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Biología de las comunicaciones volumen 6, número de artículo: 155 (2023) Citar este artículo

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El ensamblaje dinámico del complejo receptor de unión del factor sensible a N-etilmaleimida (SNARE) soluble en la sináptica es crucial para comprender la fusión de membranas. El estudio de conjunto tradicional enfrenta el desafío de diseccionar el ensamblaje dinámico del complejo proteico. Aquí, aplicamos una fuerza diminuta sobre un complejo proteico atado a través de pinzas ópticas de doble trampa y estudiamos la dinámica de plegamiento del complejo SNARE bajo fuerza mecánica regulada por complexina-1 (CpxI). Reconstruimos la abrazadera y facilitamos las funciones de CpxI in vitro e identificamos diferentes mecanismos de interacción de la unión del fragmento CpxI en el complejo SNARE. En particular, mientras que el dominio N-terminal (NTD) desempeña un papel dominante en la función facilitadora, el CTD se relaciona principalmente con el pinzamiento. Y la mezcla de 1-83aa y CTD de CpxI puede reconstituir eficientemente la señal inhibidora idéntica a la que funciona CpxI de longitud completa. Nuestra observación identifica el importante papel chaperona de la molécula CpxI en el ensamblaje dinámico del complejo SNARE bajo tensión mecánica y aclara la función específica de cada fragmento de moléculas CpxI en el proceso chaperona.

El transporte de vesículas participa en una gran cantidad de actividades celulares importantes, como la liberación de neurotransmisores, la secreción de hormonas y el transporte intracelular. El mal funcionamiento del transporte de vesículas conduce a defectos de orgánulos y disfunción celular. Se correlaciona con la aparición y desarrollo de muchas enfermedades como enfermedades neurodegenerativas, diabetes, infecciones y deficiencias inmunes. Las investigaciones sobre el transporte de vesículas fueron reconocidas repetidamente con premios Nobel. A pesar de su importancia, la comprensión del complejo y delicado transporte intracelular es todavía preliminar y tentativa, y muchos de los mecanismos reguladores más finos del transporte de vesículas aún no se han dilucidado. Entre ellas, las células nerviosas son las más representativas en el transporte de vesículas, debido a la existencia de un tipo especial de vesículas en las células nerviosas, las vesículas sinápticas, que participan en la liberación de neurotransmisores.

La liberación de neurotransmisores y la comunicación intercelular requieren la fusión de membranas, que tiene lugar en un milisegundo1. La fusión de la membrana es impulsada por proteínas de fusión cruciales, como las proteínas del receptor de unión del factor sensible a N-etilmaleimida (SNARE) solubles en la máquina molecular. Neuron SNARE incluye tres tipos de proteínas monoméricas: sintaxina, SNAP-25 (proteína asociada a sinaptosoma de 25 kDa) y VAMP (proteína de membrana asociada a vesículas)2. SNARE tiene un dominio repetido de heptanucleótido típico (motivo SNARE), en el que diferentes proteínas monoméricas SNARE contribuyen con residuos centrales de arginina (R) o glutamil (Q) en la capa iónica. Entonces, los monómeros SNARE se dividen en R- o Q-SNARE, respectivamente3. VAMP es R-SNARE y tiene un motivo SNARE. Snap-25 y Syntaxin-1 son ambos Q-SNARE, con dos y un motivo SNARE respectivamente. En la hipótesis SNARE4, diferentes vesículas tienen diferentes “SNARE vesicales” (V-SNARE, es decir, VAMP), y los miembros objetivo tienen la “SNARE objetivo” (T-SNARE, sintaxina y SNAP-25). Sólo cuando los V-SNARE y T-SNARE correctos se reconocen entre sí se puede ensamblar correctamente el complejo SNARE para impulsar la fusión de vesículas y membranas plasmáticas.

Mientras tanto, muchas proteínas reguladoras, por ejemplo, el factor sensible a N-etilmaleimida (NSF), las proteínas adaptadoras solubles de NSF (SNAP), la complexina (Cpx) y la sinaptotagmina-1, participan en la regulación de la cremallera SNARE y son cruciales para la fusión de membranas. ocurren eficientemente en el momento preciso in vivo4,5. En ausencia de SNAP y NSF, los tres monómeros SNARE se combinan para formar un haz estable de cuatro hélices, es decir, el complejo SNARE5,6. Los enfoques de conjunto tradicionales no son capaces de diseccionar el ensamblaje dinámico de SNARE y son insuficientes para registrar los estados mal ensamblados menos poblados7,8. Además, el ensamblaje funcional del SNARE ocurre en presencia de la fuerza opuesta impuesta por membranas cargadas negativamente, lo que tiene un gran impacto en la cinética y la regulación del ensamblaje del SNARE9,10.

Sin embargo, las funciones de muchos reguladores importantes no se han comprendido bien a nivel de una sola molécula. Las pinzas ópticas de una sola molécula pueden aplicar fuerza mecánica y medir la distancia en tiempo real con alta precisión y bajo fotodaño en las moléculas biológicas. Aunque el único complejo neuronal SNARE se cremallera en tres etapas distintas con el N-terminal reticulado9, aún no está claro cómo el ensamblaje dinámico SNARE está regulado por muchas proteínas, por ejemplo, la complexina. Como pequeña proteína citosólica α-helicoidal11, Cpx puede unirse al complejo SNARE y ejecuta funciones únicas12. Utilizamos pinzas ópticas de una sola molécula para estudiar el conjunto SNARE regulado por Cpx y analizar el cambio conformacional dinámico y los estados intermedios dependientes de la fuerza. Descubrimos que al entrecruzarse cerca del sitio en la capa -6 (mediante los enlaces disulfuro entre VAMP2 (Q36C) y la sintaxina 1 (L209C)), el complejo SNARE mantuvo una transición de cuatro estados en un modo de separación de trampa constante y el complejo SNARE sugirió distinguibles dinámica en presencia de varios fragmentos de moléculas CpxI debido a los respectivos sitios de unión del experimento de una sola molécula. La interacción del CpxI con el complejo SNARE funcional individual se identificaría mediante pinzas ópticas de doble trampa durante la transición dinámica bajo tensión mecánica13,14. Esta técnica de molécula única no es sólo una herramienta complementaria a los métodos de conjunto, sino que también puede detectar muchos intermediarios importantes y menos poblados involucrados en la función de la proteína. Específicamente, en la interacción del ensamblaje de CpxI y SNARE, los motivos distinguibles de las moléculas de CpxI sugieren sitios de unión y configuraciones totalmente diferentes revelados por nuestro enfoque de molécula única.

Construimos unas pinzas ópticas de doble trampa sobre un fondo de hormigón en el Sistema de Imágenes Moleculares del Centro Nacional de Ciencias de las Proteínas de Shanghai y adoptamos la detección diferencial para minimizar el ruido sistemático acoplado desde el entorno14,15,16. El instrumento también se aisló de todo el ruido ambiental, incluido el ventilador del controlador láser, y todas las operaciones se realizaron fuera de la sala aislada después de que las muestras se cargaron en los microfluidos. Las pinzas ópticas de doble trampa de alta resolución se construyeron dividiendo un láser infrarrojo de 1064 nm (Spectra Physics) con polarización ortogonal (diseño en la figura 1a). Se capturaron dos microesferas con las pinzas ópticas de doble trampa. Una microesfera recubierta con el complejo proteína-ADN se mantiene estacionaria, mientras que la otra con recubrimiento de estreptavidina se puede mover para acercarse a la microesfera estacionaria y formar una atadura (consulte la película complementaria para ver una demostración del proceso de pesca, Información de respaldo 6). A pesar de ser móvil, el punto del haz en el plano focal posterior de los objetivos es estacionario y su distribución de intensidad depende de la posición de las microesferas atrapadas. Una vez que se detecta la atadura, la trampa móvil se separa de la trampa estacionaria a cierta distancia para aplicar fuerza sobre la atadura del mango de ADN conectado con la proteína.

a Disposición de las pinzas ópticas de doble trampa. El haz de captura proviene de un láser de estado sólido con una longitud de onda central de 1064 nm. ISO, aislador; HW, placa de media onda; BD, volcado de haz; T, telescopio; PBS, divisor de haz polarizador; OBJ, objetivo de inmersión en agua; L, lentes; TL, lente de tubo; PSD, detector sensible a la posición; LED, diodo emisor de láser; DM, espejo dicroico. b Esquemas del ensayo de una sola molécula. El complejo SNARE preensamblado se entrecruzó con un mango de ADN de 2260 pb mediante un enlace disulfuro y además se unió con dos microesferas a través de digoxigenina/antidigoxigenina o biotina/estreptavidina. c Curvas de fuerza-extensión (FEC) de un único complejo SNARE durante la tracción (negro) y la relajación (gris). Las regiones continuas de las FEC correspondientes a diferentes estados de ensamblaje (marcadas con números rojos) se ajustaron utilizando el modelo de cadena en forma de gusano (líneas rojas). El recuadro muestra una vista en primer plano de la región entre dos marcadores de puntos rojos. d Trayectorias de tiempo de extensión de complejos SNARE individuales bajo separación constante de trampas. Las transiciones de estado ideales derivadas del modelo de Markov oculto (HMM) se expresan en líneas rojas. Las posiciones de los diferentes estados están marcadas con líneas discontinuas verdes y etiquetadas con los números de estado (Figura 1 complementaria, Tabla 1 complementaria). Los datos se filtraron utilizando una ventana de tiempo de 0,2 ms. Las configuraciones SNARE corresponden a los estados en trayectorias de tiempo de extensión, los números negros y L (−6 L, −2 L, +2 L) indican diferentes capas (−6 capa, −2 capa, +2 capa).

Para observar el ensamblaje SNARE reversible y regulatorio, diseñamos complejos SNARE que contienen el dominio citoplasmático completo y un sitio de entrecruzamiento entre la sintaxina y VAMP2 (sinaptobrevina-2) cerca de la capa hidrófoba -6 (Fig. 2b). Las proteínas SNARE se purificaron de forma independiente y luego se preensamblaron en complejos SNARE in vitro (Figura 2 complementaria). Nuestro experimento de unión CpxI-SNARE corroboró que CpxI no se une a ningún monómero SNARE, pero sí al complejo SNARE (Figura 3 complementaria). Se añadió un mango de ADN de 2260 pb (información de respaldo 5) que contenía un grupo tiol activado en su extremo 5' a la solución del complejo SNARE con una proporción molar de 1:20. La reticulación intramolecular e intermolecular se produjo al aire libre entre los residuos de cisteína en la sintaxina y VAMP2 (intramolecular) y entre VAMP2 y el mango de ADN (intermolecular). El mango de ADN contiene dos restos de digoxigenina en el extremo 3'. Tanto el grupo tiol como los restos de digoxigenina en el mango se introdujeron en la PCR a través de cebadores. Durante el experimento de una sola molécula, el complejo SNARE se unió a través del mango de ADN entre perlas anti-excavación y estreptavidina a través de la etiqueta de doble excavación y biotina (Fig. 1b).

a Trayectorias de tiempo de extensión de complejos SNARE individuales bajo separación constante de trampas en presencia de CpxI. La flecha indica la administración de moléculas CpxI de longitud completa de 8 μM. Las transiciones de estado ideales derivadas del modelo de Markov oculto (HMM) están superpuestas con líneas rojas. Las posiciones de los diferentes estados están marcadas con líneas discontinuas verdes y etiquetadas con los números de los estados. Los datos se filtraron utilizando un filtro de media móvil con una ventana de tiempo de 0,2 ms. b Vistas en primer plano de la región marcada por rectángulos azules discontinuos en a. Las configuraciones SNARE corresponden a los estados, los números negros y L (−6 L, +2 L) indican diferentes capas. c Las distribuciones de probabilidad de las extensiones corresponden a las trazas en a en presencia (círculo rojo) y ausencia (triángulo negro) de CpxI y sus mejores ajustes por una suma de cuatro funciones gaussianas (líneas roja y negra). Las distancias abiertas para esos estados en la Fig. 2c son \(0\) nm, \(4.6\pm 2.0\) nm, \(6.9\pm 2.3\) nm, \(14.6\pm 2.0\) nm, respectivamente, con respecto al Estado 2 (es decir, se supone que la distancia abierta para el Estado 2 es 0). d FEC de un único complejo SNARE antes (negro) y después (rojo) de la adición de CpxI 8 μM, y la línea cian es la FEC relajante después de la adición. Las FEC de los diferentes ciclos generalmente se superponen, pero se desplazaron a lo largo del eje x para mayor claridad. El recuadro muestra una vista de primer plano de la región en un rectángulo azul discontinuo.

Para manipular un único complejo SNARE, tiramos o relajamos el complejo moviendo una trampa óptica con respecto a la otra a una velocidad constante (normalmente de 20 nm/s) o mantuvimos el complejo bajo una separación constante de la trampa. Tanto la fuerza como la extensión del complejo proteína-ADN se registraron a 10 kHz. Habíamos intentado entrecruzar el SNARE en cuatro sitios (capa −1, −2, −3, −6, Figura complementaria 4, Figura complementaria 5, Información de respaldo 8), sin embargo, solo el entrecruzamiento en dos de ellos (−2, y -6 capas) tuvieron éxito en el experimento posterior de una sola molécula ya que la probabilidad de formar una unión efectiva era muy baja para las construcciones reticuladas en -1 o -3 capas. Para permitir que CpxI interactúe lo suficiente con fragmentos NTD más largos en SNARE, la mayoría de los datos asumen un enlace cruzado en la capa −6, de modo que la región de interacción en el complejo SNARE sea máxima. Cuando la fuerza aumenta a 7 ~ 13 pN, observamos un salto lento de ~ 3 nm (entre los estados 1 y 2 en la Fig. 1c) correspondiente a la apertura del dominio enlazador del complejo SNARE9,13. El SNARE pasa del estado 1 completamente cerrado/plegado al estado 2 del enlazador abierto cuando se desmonta el dominio del enlazador. Sin embargo, cuando la fuerza aumenta a 17~19 pN9, el complejo SNARE salta entre cuatro estados (estado 2-5) con una diferencia de extensión máxima de ~15 nm (Fig.1c) consistente con el enlace cruzado en la capa −69,13. ,18. Por lo tanto, la disociación completa del complejo SNARE en el dominio medio (MD, estado 3-4) y N-terminal (estado 4-5) no ocurre inmediatamente después del ensamblaje del complejo SNARE en el C-terminal (estado 2 -3), debido a la existencia de un sitio de nucleación para el cierre de NTD en el extremo N de la capa -613. Por lo tanto, la transición entre los estados 2 a 5 es diferente de la señal de salto + corte del complejo SNARE de enlace cruzado de −7 capas (o denominado enlace cruzado N-terminal)9. En este caso, la lenta disociación del haz de cuatro hélices del complejo SNARE está representada por el salto continuo (entre los estados 2 y 5 en la Fig. 1c). Observe que hay una disociación del dominio medio (MD) del complejo SNARE (estados 3-4) cerca de la capa iónica central (capa 0). Cuando la fuerza continúa aumentando, aparece un desgarro en la gota de SNAP25 que no está unida por un enlace disulfuro. Cuando la fuerza disminuye gradualmente por debajo de 5 pN, el complejo SNARE no pudo volver a su ensamblaje completo debido a la ausencia de SNAP25 (Fig. 1c, curva gris). La curva de fuerza-extensión del ADN del mango se ajustaría utilizando el modelo de cadena tipo gusano19 (curva discontinua en la figura 1c). La figura 1d ilustra una traza típica de tiempo de extensión cuando la separación de la trampa se mantiene fija con una fuerza promedio aplicada de ~19 pN. El complejo SNARE transitaría entre 4 estados en equilibrio (estado 2-5, Fig. 1d), que corresponden a las cuatro conformaciones diferentes del complejo SNARE: el dominio enlazador se abre (Estado 2), el terminal C se despliega a la capa +2 (Estado 3), MD se despliega a -1 capa (estado 4) y el N-terminal se despliega antes de la caída de SNAP-25 (estado 5).

Para caracterizar el ensamblaje/desmontaje de SNARE dependiente de CpxI, medimos las trayectorias de tiempo de extensión con una cierta fuerza promedio donde SNARE transita entre 4 estados (Fig. 2a). En primer lugar, el complejo SNARE capturado se estiró durante un ciclo completo para comprobar el correcto montaje (ver vídeo complementario del proceso de pesca) y determinar la fuerza de equilibrio del estado intermedio. La fuerza de equilibrio promedio generalmente está entre 18 y 20 pN. La distribución general de la fuerza de equilibrio de las diferentes moléculas SNARE se aproxima a una distribución normal para todo el complejo SNARE medido. Se sostuvo un complejo SNARE individual mediante pinzas ópticas de doble trampa con una separación de trampa fija, y se suministró CpxI 8 μM en un canal separado ("canal de proteína", Figura 6 complementaria) para administrar directamente moléculas de CpxI a la región donde se pliega SNARE. /se desarrolló. Cpx consta de cuatro dominios, dominio N-terminal (NTD, 1-26 aa), hélice accesoria (AH, 26-48 aa), hélice central (CH, 48-70 aa) y dominio C-terminal (CTD, 70- 134 aa) (insertado en la Fig. 2a). La estructura cristalina del complejo Cpx/SNARE y los experimentos de mutagénesis han revelado que el CH está directamente asociado con los SNARE, lo cual es esencial para que Cpx ejecute su función20,21.

En presencia de CpxI de longitud completa 8 μM, 49 complejos SNARE cambiaron su estado después de la adición de CpxI. Para el 45% de ellos (22 moléculas), la distribución de los complejos SNARE cambió de 2 ~ 5 estados a 3 ~ 5 estados (Fig. 2a-d, Figura complementaria 7), lo que implica que el ensamblaje y desmontaje reversible se limita a N -terminal, y la transición del terminal C no está permitida (estado bloqueado del terminal C). Como se menciona en la información complementaria 6, la velocidad de la señal se define como la relación entre una señal particular y la suma de todas las señales (Información de respaldo 12). Además, las curvas de FEC cambiaron en gran medida en comparación con aquellas en ausencia de CpxI (Fig. 2d). La mayoría del complejo SNARE no podía cerrar completamente incluso si la fuerza cayera por debajo de 5 pN (Fig. 2d, estado de sujeción del terminal C, línea cian), lo que sugiere que CpxI podría insertarse en el terminal C de SNARE e inhibir el cierre completo del complejo SNARE. (Figuras 2a-d). El análisis HMM de las trayectorias de tiempo de extensión sugiere que el complejo SNARE estaba bloqueado en el estado bloqueado C-terminal en presencia de CpxI de longitud completa 8 μM (1-134 aa) (Fig. 2c, antes: negro, estado 2-5; después: rojo, estado 3-5). Esta señal corresponde a la función de sujeción de CpxI: inhibir el ensamblaje completo del complejo SNARE.

También observamos que CpxI podía sujetar el complejo SNARE en el estado exacto de media cremallera (estado de sujeción media, 7 moléculas, tasa de señal del 14%, Figs. 2a, b, d). En consecuencia, el plegamiento dinámico del complejo SNARE solo tuvo lugar entre 3 y 4 estados en esta situación (Figura complementaria 8a). Continuamos estirando este complejo aumentando la fuerza y ​​descubrimos que es esencial una fuerza mayor para romper este estado de medio cierre. Esto corroboró que CpxI puede inhibir el ensamblaje C-terminal de los complejos SNARE y, simultáneamente, estabilizar el N-terminal. Esta observación también corroboró los estudios conjuntos sobre la función de sujeción del CpxI en estado fisiológico.

Sorprendentemente, el complejo SNARE también puede mantenerse en el estado estabilizado C-terminal después de la adición de CpxI (estado estabilizado C-terminal, 20 moléculas, tasa de señal del 41%, Fig. 2a, b, d). En consecuencia, los complejos SNARE han pasado de saltar entre 2 a 5 estados a mantenerse solo en el estado 2 con la adición de CpxI (Figura complementaria 8b). Un mayor estiramiento de las moléculas con una fuerza elevada rompería este estado estabilizado C-terminal, lo que indica la capacidad de CpxI para estabilizar el haz de cuatro hélices de complejos SNARE.

Además, en el proceso de rondas consecutivas al tirar y relajar el mismo complejo SNARE, la posibilidad de que aparezca la misma señal en el ciclo posterior después de una determinada señal es superior al 80%, lo que indica que el mismo CpxI se combina con el mismo SNARE en múltiples ciclos de tracción y relajación (Fig. 2d). Esto corrobora que la unión de Cplx al complejo SNARE es mucho más fuerte que el despliegue del complejo SNARE.

Para descubrir la función específica de múltiples dominios en la dinámica de transición SNARE dependiente de CpxI, introdujimos diferentes truncamientos de CpxI en el complejo SNARE de transición única, incluidos 1-83 aa, 26-83 aa, 48-73 aa, mezcla de 1 -83 aa y 83-134 aa (Fig. 3a). Sorprendentemente, encontramos que las señales de plegamiento SNARE en presencia de 1-83 aa (carecen del CTD de CpxI en comparación con CpxI de longitud completa) fueron las más consistentes entre todos los tipos de fragmentos de CpxI. En presencia de 8 μM 1-83 aa de CpxI, 49 moléculas dinámicas del complejo SNARE cambiaron su estado después de la adición de CpxI, mientras que otras 13 moléculas no mostraron cambios después de la adición. Curiosamente, entre estos 49 complejos SNARE con cambios de configuración significativos, el 94% (46 moléculas) de sus trazas de tiempo de extensión sugieren que el complejo SNARE se estabilizó en el estado estabilizado C-terminal, y se requirió mayor fuerza para disociar aún más la molécula CpxI ( Figura 3b). Y otros 3 complejos SNARE (6%) se limitaron a la transición N-terminal. Obviamente, el dominio 1-83 aa de CpxI estabiliza el SNARE en el estado estabilizado C-terminal. En otras palabras, 1-83 aa solo puede implementar la función de facilitación.

a Esquemas de los fragmentos de dominio del CpxI utilizados en los experimentos. b Trayectorias de tiempo de extensión de complejos SNARE individuales bajo separación constante de trampas que muestran la cinética de despliegue de SNARE antes y después de la adición del fragmento 1-83aa de 8 μM de CpxI en presencia de una fuerza promedio de (i) 17,5 pN y (ii) 19 pN. . c La distribución de la fuerza de despliegue de los complejos SNARE con (naranja) o sin (azul) fragmentos de 1-83 aa. El salto tiene lugar a ~21 pN en ausencia de CpxI, mientras que la fuerza promedio aumenta a ~24 pN y algunos eventos ocurren con una fuerza aún mayor de ~43 pN. d Curvas de fuerza-extensión (FEC) de un único complejo SNARE antes (negro) y después (rojo) de la adición de 8 μM 1-83 aa. El dominio 1-83 aa de CpxI estabiliza el conjunto SNARE en el estado estabilizado C-terminal, para el cual el 59% de las FEC cambiaron ligeramente con un aumento de hasta 5 pN (#1) en la fuerza descomprimida del C-terminal SNARE. , y el 34 % de la curva de fuerza-extensión (FEC) cambió drásticamente con un aumento de más de 5 pN (#2) en la fuerza descomprimida del terminal C de SNARE.

La exocitosis de neurotransmisores y hormonas es un proceso estrictamente controlado que ha evolucionado para alcanzar la precisión temporal y la velocidad de la comunicación intercelular. Cpx es probablemente la proteína que interactúa con SNARE y que participa en la exocitosis de forma más controvertida. El estudio del mecanismo regulador del complejo SNARE tiene un sentido importante para completar la teoría de la fusión de vesículas y orienta el tratamiento clínico de las enfermedades relacionadas. La exocitosis podría desencadenarse por la interacción de múltiples dominios con el complejo SNARE. Para examinar el efecto de CpxI en el cierre de SNARE, observamos una serie de estados prominentes de permanencia prolongada en el proceso de transición rápida de SNARE después de la introducción de 8 μM de longitud completa y diferentes tipos de CpxI truncado.

Las fuerzas de despliegue del C-terminal en los complejos SNARE se distribuyen normalmente alrededor de un promedio de ~ 21 pN (Fig. 3c, primera línea discontinua azul, Figura complementaria 9). Sin embargo, en presencia de CpxI, las fuerzas de despliegue del C-terminal en los complejos SNARE aumentaron de manera diferente. En estas señales estabilizadas del C-terminal, la fuerza de apertura del C-terminal para el 34% de los complejos SNARE bajo estudio aumentó en más de 5 pN, y la fuerza de apertura para el 59% de los complejos SNARE del C-terminal aumentó hasta 5pN (Fig. 3c, d).

El NTD (1-26 aa) es un dominio importante de CpxI para estabilizar el terminal C del complejo SNARE22,23; específicamente, la capacidad de CpxI para estabilizar el complejo SNARE puede depender principalmente de su NTD. Para identificar el papel de NTD en el desmontaje SNARE dependiente de CpxI, eliminamos el NTD en la construcción de CpxI. En presencia de CpxI 26-83 aa, 38 moléculas dinámicas cambiaron su estado después de la adición de CpxI (Fig. 4a, b). Curiosamente, las trazas del tiempo de extensión de 25 moléculas (66%) todavía estaban estabilizadas en el C-terminal (Figura 10 complementaria), mientras que la transición C-terminal de 12 complejos SNARE estaba bloqueada (31,5%, Fig. 4a, b). En cuanto a la última señal, la mayoría de los complejos SNARE tampoco pudieron lograr un cierre completo incluso si la fuerza cayera por debajo de 5 pN (Fig. 4c, línea cian). La tasa de estado estabilizado C-terminal disminuyó dramáticamente, lo que demuestra que la eliminación de NTD causó grandes cambios en el desmontaje SNARE dependiente de CpxI (Fig. 4d), lo que indica que CpxI estabiliza el complejo SNARE de manera crítica dependiendo de su dominio N-terminal. (NTD, 1-26 aa). Esto proporciona evidencia de una sola molécula para respaldar informes anteriores sobre que el dominio NTD de CpxI se localiza en el punto donde el complejo trans-SNARE se inserta en las membranas de fusión24, o bloquea el C-terminal del complejo SNARE en ausencia de una señal desencadenante de la fusión del miembro23. 25.

En presencia de dominio AH-CH 8 μM (26-83 aa), 38 de 66 (57,5%) moléculas dinámicas cambiaron su estado después de la adición del fragmento CpxI. a Las trayectorias de tiempo de extensión yb la vista ampliada de las trazas en el rectángulo discontinuo sugieren que el 66% de ellas se estabilizó al estado estabilizado C-terminal después de la adición del dominio AH-CH de 8 μM (26-83 aa) en tiempo real. Al mismo tiempo, el 31,5% del complejo SNARE se bloqueó en el estado bloqueado C-terminal después (rojo) de la adición del dominio AH-CH 8 μM. Para la adición de un fragmento más corto del dominio CH (8 μM, 48-73 aa), 26 de 32 (81%) moléculas dinámicas cambiaron su estado en presencia del fragmento CpxI. c Curva FEC, negro: tirando antes de la adición de CpxI, gris: relajándose antes de la adición de CpxI, rojo: tirando después de la adición de CpxI, cian: relajando después de la adición de CpxI. d Resumen de la distribución de los diferentes tipos de señales introducidas por fragmentos de 1-83 aa o 26-83 aa. e FEC de complejos SNARE únicos en presencia de un dominio meramente CH. El 96% del complejo SNARE quedó bloqueado en el estado bloqueado C-terminal después (rojo) de la adición del dominio CpxI CH. Se aplicó la prueba t pareada para evaluar las estadísticas con un valor p de *p < 0,04, **p < 0,002 y ***p < 10-8.

Se cree que el dominio CH (48-73 aa) de Cpx es el fragmento más pequeño que se une directamente al complejo SNARE24. Suministramos 8 μM de dominio CH de CpxI al experimento del complejo SNARE de una sola molécula y descubrimos que CpxI CH inhibe ligeramente el ensamblaje del C-terminal del complejo SNARE (Fig. 4a, b). Específicamente, 26 moléculas cambiaron su estado después de la adición de CpxI, y el 96% de su transición C-terminal se bloqueó ligeramente (25 moléculas, Fig. 4e). Sin embargo, estas moléculas mostraron un ensamblaje completo a medida que la fuerza disminuye (la línea cian en la Fig. 4e), bastante diferente del efecto de otros fragmentos CpxI más largos (la línea cian en la Fig. 2f, 4c). Un fragmento mucho más corto de CpxI 48-73 aa inhibe sólo ligeramente el plegado del complejo SNARE en el CTD y es insuficiente para sujetar fuertemente el complejo SNARE en el estado bloqueado C-terminal.

Se produjo una interacción débil entre el CH individual (48-70 aa) y el complejo SNARE, ya que la orientación adecuada y funcional necesita la cooperación de otros dominios en CpxI. Las estructuras cristalinas del complejo Cpx:SNARE muestran diferentes superficies de interacción para Cpx de diferentes longitudes. Para Cpx 32-72 aa26 o 24-73 aa26, el Cpx CH (48-70 aa) se une al complejo SNARE en el dominio medio alrededor de la capa 0 ~ +1; para un Cpx 49-76 aa más corto (que contiene casi solo CH)21, el Cpx CH se une al C-terminal proximal del complejo SNARE. Cuando el péptido Cpx es demasiado pequeño, la posición de unión de CH se mueve hacia el C-terminal del complejo SNARE. Esto sugiere que si el fragmento Cpx es demasiado corto (solo CH), es probable que se produzcan interacciones débiles o incluso erróneas, porque la unión funcional de Cpx requiere la coordinación de otros dominios Cpx. Nuestro experimento con pinzas ópticas de una sola molécula ha corroborado que la región con 26–83 aa en CpxI es el "dominio de sujeción mínimo" de la proteína27,28. Específicamente, el CpxI depende críticamente de su NTD (1-26 aa) para estabilizar el complejo SNARE.

Análisis funcionales recientes con C. elegans Cpx revelaron que los efectos inhibidores de CpxI son importantes pero no suficientes para la unión a la membrana29,30, lo que lo hace misterioso para las interacciones del extremo C de Cpx para detener la fusión de vesículas. Por la presente, dilucidamos si CTD es funcional en ausencia de fosfolípidos. CpxI CTD no puede unirse directamente a SNARE en ausencia de CH, y el fragmento CTD (83-134 aa) no se une a 1-83 aa (Figura 11 complementaria). Introducimos el fragmento CTD (83-134 aa) combinado con 8 μM 1-83 aa de CpxI para interactuar con el complejo SNARE durante el ensamblaje dinámico. Este esquema es similar a la adición de CpxI de longitud completa, pero cada molécula de CpxI se separa en dos partes. Inesperadamente, 18 moléculas del complejo SNARE cambiaron sus estados después de la adición de un fragmento de 1-83 aa 8 μM y de 83-134 aa 8 μM (con una relación molar de 1:1); 21 moléculas del complejo SNARE cambiaron su estado después de la adición de 8 µM 1-83 aa y 16 µM 83-134 aa (relación molar 1:2); 22 moléculas del complejo SNARE cambiaron su estado después de la adición de 8 μM 1-83 aa y 24 μM 83-134 aa (relación molar 1:3) (Fig. 5a-c, Figura complementaria 12). Diferentes combinaciones de fragmentos CpxI conducen a diferentes tipos de distribución de señales (Fig. 5c).

a Las trayectorias de tiempo de extensión de complejos SNARE individuales muestran la cinética de despliegue de SNARE antes y después de la adición de fragmentos de 8 μM de 1-83 aa y fragmentos de 8/16/24 μM de 83-134 aa en tiempo real. b Distribuciones características de densidad de probabilidad de las extensiones correspondientes a las trazas en A y sus mejores ajustes a una suma de cuatro funciones gaussianas (líneas rojas). c La distribución de diferentes tipos de señales introducidas por el fragmento 1-83 aa de Cpx, Cpx de longitud completa y la mezcla de 1-83 aa y 83-134 aa con varias proporciones. Con el aumento de la concentración de CTD, aumenta la proporción del estado C-terminal bloqueado y del estado medio fijado, mientras que la proporción del estado C-terminal estabilizado disminuye. Cuando la relación alcanza 1:3, los tipos de señales y la porción de señal son idénticos a los del CpxI de longitud completa. Se aplicó la prueba t pareada para evaluar las estadísticas con un valor p de *p < 0,04, **p < 0,002 y ***p < 10-8.

Curiosamente, la proporción del estado bloqueado del C-terminal y del estado de sujeción media aumenta con el aumento de la concentración del fragmento CpxI CTD, mientras que la proporción del estado estabilizado del C-terminal disminuye (Fig. 5c). Mientras tanto, la probabilidad del estado bloqueado del terminal C y del estado de sujeción media (abrazadera) también aumenta con la concentración. Sorprendentemente, se sujetaron más complejos SNARE al estado medio: no pueden volver a ensamblarse en un complejo completamente ensamblado y necesitan una fuerza mayor para romper el estado medio cerrado. Además, la función de sujeción de Cpx puede reconstituirse mediante el fragmento 1-83 aa de CpxI y su CTD como fragmentos separados in vitro (Fig. 5c, dos últimas columnas). Por lo tanto, no se requiere continuidad física a lo largo de CpxI para establecer la función de sujeción. CTD de CpxI inhibe la cremallera completa del complejo SNARE y juega un papel importante en la función de pinza. Además, CTD (70-134 aa) está relacionado principalmente con la función de sujeción, y CTD 1-83aa y CpxI separados pueden reconstituir eficientemente la señal inhibidora idéntica a la de las funciones CpxI de longitud completa (Fig. 5). El extremo Cpx C-terminal compite con SNAP25-SN1 por la unión al complejo SNARE y, por lo tanto, detiene la formación progresiva del complejo SNARE antes de la activación31. Nuestro estudio reveló que el rescate de la función de Cpx de longitud completa requiere una alta concentración de CpxI CTD, y abundante péptido CTD es capaz de mejorar la función inhibidora de CpxI31.

CpxI sujeta los complejos SNARE preensamblados en un "estado de enlace abierto" revelado por el experimento de pinzas magnéticas32. Sin embargo, el complejo SNARE no está en estado funcional cuando el CpxI está preensamblado con el complejo SNARE. El descompresión de los complejos SNARE preensamblados se produjo con un nivel de fuerza más alto de ~2 pN en promedio con la inclusión de CpxI32. Por el contrario, el experimento de pinzas ópticas de una sola molécula permite el estudio de la dinámica de plegamiento del complejo SNARE en un estado funcional. Nuestro experimento con pinzas ópticas de una sola molécula sugiere que el CpxI puede introducir el "estado estabilizado C-terminal", el "estado de sujeción media" y el "estado bloqueado C-terminal" (Figs. 1, 4 y 5). Para determinar el dominio crítico para cada tipo de señal, en la Fig. 6a se resumen las apariciones de señales para la interacción de SNARE con tres fragmentos representativos en CpxI, es decir, 1-83 aa, 26-83 aa, 83-134 aa.

a Resumen de la velocidad de la señal del complejo SNARE en presencia de varios truncamientos. Con la inclusión del CTD (compárese la columna 5 con la columna 3), la proporción total de estado bloqueado en el terminal C (parte verde) y estado de sujeción media (parte rosa) aumenta y, mientras tanto, con la eliminación de NTD (compárese la columna 4 a la columna 3), la proporción del estado estabilizado C-terminal (parte violeta) disminuye. Se aplicó la prueba t pareada para evaluar las estadísticas con un valor p de *p < 0,02, **p < 0,03 y ***p < 0,0001. b Modelos de función de pinza de complexina. (1) Modelo de unión directa AH. (2) Modelo competitivo AH. Nuestros datos existentes prefieren el modelo completo (3)CTD.

Además, la tensión mecánica en complejos SNARE preensamblados individuales se manifestó solo en un rango estrecho, concretamente entre 13 y 16 pN. Sin embargo, nuestro experimento de una sola molécula sugiere que la interacción de CpxI existe en un rango de fuerza más amplio de 5 a 40 pN. El CH en CpxI también puede estabilizar el haz de cuatro hélices del complejo SNARE preensamblado; sin embargo, nuestro estudio dinámico utilizando el SNARE funcional indica que el CpxI CH no pudo estabilizar el complejo SNARE ni siquiera unirse funcionalmente al complejo SNARE. Nuestra observación es consistente con los análisis in vitro en células Hela realizados por Rothman y sus colegas, quienes demarcaron una región que comprende los aminoácidos 26 a 83 de CpxI como el "dominio de sujeción mínimo" de la proteína.

El estudio de las pinzas magnéticas sugiere que la eliminación del dominio C-terminal no tuvo un efecto apreciable en ninguno de los aspectos de la función Cpx, pero nuestro estudio proporciona prueba directa del papel activo de CpxI CTD en la función de sujeción para inhibir la fusión de membranas (Fig. 6a) .

En presencia de CpxI de longitud completa, el complejo SNARE se puede introducir en tres tipos de señales. Para el estado bloqueado C-terminal, la distribución de los complejos SNARE cambió de 2 ~ 5 estados a 3 ~ 5 estados (Fig. 2a-d), lo que implica que el ensamblaje y desmontaje reversible se limita al N-terminal, y la transición del terminal C no está permitido (estado bloqueado del terminal C). Para el estado de sujeción media, el plegamiento dinámico del complejo SNARE solo tuvo lugar entre 3 y 4 estados en esta situación (Fig. 2a, b, d). El complejo SNARE también puede mantenerse en el estado estabilizado C-terminal después de la adición de CpxI (estado estabilizado C-terminal, Fig. 2a, b, d). En consecuencia, los complejos SNARE han pasado de saltar entre 2 a 5 estados a mantenerse solo en el estado 2 con la adición de CpxI.

Los 1-83 aa de CpxI pueden estabilizar poderosa y dominantemente el haz de cuatro hélices del complejo SNARE en el C-terminal (Figs. 3, 1-83 aa en la Fig. 6a). La probabilidad de un estado bloqueado C-terminal aumenta una vez que se elimina el NTD (1-26 aa) (26-83 aa en la Fig. 6a), acompañado de una inhibición del estado estabilizado C-terminal. Sin embargo, el CTD (83-134 aa) de CpxI bloquea de manera dominante el terminal C de SNARE (83-134 aa, en la Fig. 6a). 1-83 aa de CpxI es insuficiente para bloquear la cremallera C-terminal del complejo SNARE en comparación con CpxI de longitud completa, debido a la falta de CTD.

La unión entre CH y SNARE es el requisito previo de la función de sujeción; se propusieron varios modelos para explicar la interacción entre AH y SNARE con media cremallera33,34. Nuestro experimento de molécula única sobre la interacción de varios fragmentos de CpxI y el complejo SNARE proporciona soporte de molécula única para el modelo de unión de AH (Fig. 6b1) en lugar del modelo de competencia de AH con VAMP c-terminal (Fig. 6b2). Esto también es consistente con el experimento de cocristalización, que sugiere que Cpx se une al C-terminal de VAMP en lugar de competir33.

La controversia entre estos dos modelos (Fig. 6b1, 2) está en el sitio de unión de CpxI AH. El experimento con longitud completa sugiere que el C-terminal SNARE se puede estabilizar/bloquear (sujetar) después de la adición de CpxI, y los fragmentos CpxI 1-83 aa solo pueden estabilizar el C-terminal del complejo SNARE. Si el CpxI de longitud completa realizó la función de sujeción (estado bloqueado del terminal C) mediante un modelo competitivo (Fig. 6b2), el sitio de unión de CpxI AH está en t-SNARE sin VAMP C-terminal (Vc). Cuando Vc se vuelve a cerrar con cremallera al haz de cuatro hélices, no hay ningún sitio de unión para CpxI AH en el estado estabilizado C-terminal.

Por el contrario, si el CpxI de longitud completa realizó la función de sujeción (estado bloqueado del terminal C) mediante el modelo de unión directa (Fig. 6b1), el sitio de unión de CpxI AH está en Vc. Cuando Vc se cierra con cremallera nuevamente al haz de cuatro hélices, todavía existe el sitio de unión para CpxI AH en el estado estabilizado C-terminal. Es más, para la función de sujeción, sugerimos que CpxI CTD inserte el terminal C del complejo SNARE para competir con Vc o t-SNARE (prefiera t-SNARE (modelo completo de CTD en la Fig. 6b3) en lugar de CpxI AH (AH modelo de competencia en la Fig. 6b2), que está respaldado por nuestros datos mencionados a continuación.

Los 1-83 aa de CpxI pueden estabilizar poderosamente el haz de cuatro hélices del complejo SNARE (Fig. 3). Una vez que se inyectó el fragmento complementario 83-134 aa (principalmente parte de CTD, sin CH), y 18 de 27 complejos SNARE (67%) no mostraron cambios (segunda columna de la Fig. 6a, la definición de velocidad de señal en información complementaria 7 ), que fue un control negativo para los experimentos en la Fig. 5. El 1-83 aa estabiliza predominantemente el SNARE en el terminal C (1-83 aa en la Fig. 6a). La probabilidad de un estado bloqueado C-terminal aumenta una vez que se elimina el NTD (1-26 aa) (26-83 aa en la Fig. 6a), acompañado de una inhibición del estado estabilizado C-terminal. Sin embargo, el CTD (83-134 aa) de CpxI bloquea de manera dominante el terminal C de SNARE (83-134 aa, en la Fig. 6a). 1-83 aa de CpxI es insuficiente para bloquear la cremallera C-terminal del complejo SNARE en comparación con CpxI de longitud completa, debido a la falta de CTD.

El experimento con un mezclador de fragmentos CpxI (83-134 aa y 1-83 aa) sugiere que el C-terminal SNARE se vuelve más bloqueado cuando el CpxI CTD (83-134 aa) aumenta, mientras que la proporción del estado estabilizado del C-terminal disminuye ( Figura 5c). Además, la función de sujeción de Cpx puede reconstituirse mediante el fragmento 1-83 aa de CpxI y su CTD como fragmentos separados in vitro (Fig. 5c, dos últimas columnas). Por lo tanto, no se requiere continuidad física a lo largo de CpxI para establecer la función de sujeción. CTD de CpxI inhibe la cremallera completa del complejo SNARE, además de que CH es responsable de la combinación directa de Cpx y SNARE, CTD es responsable de inhibir el ensamblaje C-terminal de los complejos SNARE. Mientras tanto, es bastante razonable que AH se combine con el VAMP C-terminal que está lejos de t-SNARE. Tras la llegada de la señal de estímulo que facilita la fusión de la membrana, esta función de sujeción de CTD se elimina, CH aún mantiene la unión básica, AH puede ensamblarse con el terminal VAMP C más cerca del complejo SNARE, mientras que NTD desempeña su papel de facilitador, y juntos estabilizan el complejo SNARE ensamblado con cuatro haces en espiral. Para que NSF no degrade inmediatamente el complejo ensamblado, hasta que se complete la liberación del contenido de la vesícula.

Nuestra observación de una sola molécula reveló dos funciones del CpxI durante la interacción con el complejo SNARE. El CpxI de longitud completa sujeta el complejo SNARE en un estado de media cremallera sin Ca2+, mientras que el CTD se repliega para sujetarlo (el CTD podría tener una conformación helicoidal). Luego, NTD y Synaptotagmin ayudan al complejo SNARE a completar el ensamblaje y estabilizar el haz de cuatro hélices del complejo SNARE para realizar la liberación del neurotransmisor.

En resumen, el experimento con pinzas ópticas proporciona evidencia directa de una sola molécula de la interacción entre CpxI y el complejo SNARE en el estado funcional que imita la condición fisiológica real. Construimos las pinzas ópticas de doble trampa con detección diferencial y medimos las diferentes cinéticas de plegado de los complejos SNARE en ausencia y presencia de CpxI tanto de tipo salvaje como mutante/truncado. Una serie de fragmentos cortos sintéticos de CpxI interactúa con el conjunto SNARE. En particular, la región 1-83 aa de CpxI puede estabilizar el haz de cuatro hélices de motivos SNARE (facilitar), y la capacidad de CpxI para estabilizar el complejo SNARE depende críticamente de su NTD. Además, los dominios 1-83aa y C-terminal separados de CpxI pueden reconstituir eficientemente la señal inhibidora del CpxI de longitud completa. La región con 26–83 aa en CpxI es el "dominio de sujeción mínimo" de la proteína27,28. Los Cpx NTD tienen un impacto crítico en la función de facilitación de Cpx, mientras que Cpx CTD desempeña un papel activo en la función de sujeción. En conjunto, nuestros resultados brindaron información sobre los mecanismos fundamentales de la exocitosis. Específicamente, múltiples dominios trabajan cooperativamente para garantizar que el CpxI de longitud completa funcione como un interruptor molecular activado por calcio: sujeta el complejo SNARE en el estado de media cremallera en el estado preparado de la vesícula y acelera el complejo SNARE para completar el ensamblaje en un estado completamente cerrado. estado plegado en respuesta a un estímulo (p. ej., activado por Ca2+) en el estado fisiológico. Anticipamos que las pinzas ópticas de doble trampa se aplicarían aún más para abordar enfermedades importantes, como las enfermedades de Alzheimer y Huntington, rastreando el diminuto estado mal plegado bajo tensión mecánica.

El complejo SNARE sináptico reticulado de -6 capas consta de VAMP2 (1-92, C2A, Q36C), sintaxina 1 (172-265, C173A, L209C) y SNAP25 (1-206). Se generaron mutaciones de sustitución o truncamiento en proteínas SNARE y Cpx (C105A, 1-83, 26-83, 26-134, 83-134) mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de extensión superpuesta utilizando cebadores respectivos que contenían las secuencias no homólogas deseadas35. Todas las mutaciones fueron confirmadas mediante análisis de secuencia de ADN (BioSune, China). Los genes correspondientes a la sintaxina y VAMP2 y el Cpx anterior se insertaron en vectores pET-SUMO mediante clonación TA. Luego, las proteínas se expresaron en células E. coli BL21 (DE3) y se purificaron como se describe en el manual de ChampionTM pET SUMO Expression System (Invitrogen). Normalmente, los sedimentos de células de E. coli se resuspendieron en HEPES 25 mM, KCl 400 mM, glicerol al 10%, imidazol 10 mM, pH 7,7 (HEPES 25 mM, NaCl 800 mM, glicerol al 5%, β-Me 2 mM, Tritón al 0,2%). X-100, pH 7,5 para Cpx) y se disgregaron mediante sonicación en hielo para obtener lisados ​​celulares claros. A continuación, los lisados ​​se aclararon mediante centrifugación. Las proteínas SNARE en el sobrenadante se unieron a la resina Ni-NTA y se lavaron aumentando las concentraciones de imidazol hasta 20 mM. La proteína sintaxina se biotiniló in vitro mediante la enzima biotina ligasa (BirA) como se describe (Avidity, CO). Finalmente, las etiquetas His-SUMO en ambas proteínas se escindieron directamente en resina Ni-NTA incubando las proteínas SNARE/lechada de resina marcadas con proteasa SUMO (con una proporción de masa de proteína a proteasa de 100:1) a 4 °C durante la noche. . Las proteínas SNARE se recogieron en el flujo continuo mientras la etiqueta His-SUMO se retenía en la resina. SNAP25 se expresó a partir del vector pET-28a y se purificó a través de su etiqueta His N-terminal. Todas las proteínas SNARE se purificaron en presencia de TCEP 2 mM para evitar reticulaciones no deseadas. Yochem Biotech sintetizó los péptidos de Cpx (48-73 aa). Todo el Cpx se transfirió al tampón HEPES (25 mM de HEPES, NaCl 50 mM, CA630 al 0,02%, pH 7,4) antes del experimento con pinzas ópticas.

Se formaron complejos ternarios SNARE mezclando proteínas sintaxina, SNAP25 y VAMP2 con proporciones molares de 3:4:5 en HEPES 25 mM, NaCl 150 mM, TCEP 2 mM, pH 7,7 y la mezcla se incubó a 4 °C durante 30 minutos. Aquí, se introduce el TCEP para evitar la formación de polímero a través del enlace disulfuro entre múltiples SNARE. La formación del complejo ternario se confirmó mediante electroforesis en gel de poliacrilamida SDS. El exceso de monómeros SNARE o complejos binarios se eliminaron del complejo ternario mediante una purificación adicional a través de resina Ni-NTA utilizando His-Tag en la molécula SNAP25. La reticulación intramolecular media alrededor de la capa −6 entre VAMP2_V57C y Syntaxin_L222C se produjo a 34 °C, 300 rpm, 16 h a una concentración baja de 100 mM en tampón fosfato, NaCl 0,5 M, pH 8,5 sin TCEP. Luego, el mango de ADN de 2260 pb que contenía un grupo tiol activado en su extremo 5' se añadió a la solución del complejo SNARE, que acababa de concentrarse a más de 70 μM, con una relación molar del complejo SNARE al mango de ADN de 20:1. La reticulación intermolecular se produjo al aire libre entre VAMP2 y el mango de ADN, respectivamente, en tampón fosfato 100 mM, NaCl 0,5 M, pH 8,5. El mango de ADN también contiene dos restos de digoxigenina en el otro extremo. Tanto el grupo tiol como los restos de digoxigenina en el mango se introdujeron en la reacción de PCR a través de cebadores. El exceso de complejos SNARE en la mezcla de reticulación se eliminó después de que se unieran los conjugados de ADN-complejo SNARE correctos a las perlas recubiertas con anti-digoxigenina.

La fuente láser es un láser de onda continua con una longitud de onda central de 1064 nm (J20I-BL-206C, personalizado con un haz de fibras de 10 m, Spectra-Physics). El láser se aisló del reflejo posterior con un aislador electroóptico (IO-3-1064-VHP, Thorlabs) para evitar daños y desestabilización de la cavidad del láser. Una placa de media onda (HW1) en combinación con un divisor de haz polarizador (PBS1) controla la potencia total entregada a las pinzas ópticas de doble trampa. Una segunda placa de media onda (HW2) ajusta la relación de potencia entre dos trampas láser. El primer telescopio expande el haz a ~4 mm de diámetro. Luego, el haz expandido se dividió y combinó mediante un par de divisores de haz de polarización (PBS2 y PBS3). Un haz se mantendrá fijo, mientras que el otro se dirige mediante un espejo móvil impulsado por una etapa piezoeléctrica (Nano-MTA2X, MadCity Labs Inc). Un segundo telescopio T2 expande el diámetro del haz al doble y retransmite el piezoespejo al plano focal posterior (BFP) del objetivo de captura (OB1, NA = 1,2, UPLSAPO60XWIR-2, Olympus). Aquí, para maximizar la eficiencia de la detección, adoptamos dos objetivos idénticos (OBJ1 y OBJ2) para captura y detección. Ambos objetivos están optimizados para una alta transmisión (>80%) en la longitud de onda de captura (1064 nm).

La detección de posición se realizó a través de dos detectores sensibles a la posición (PSD, DL100-7 PCBA3, sílice del Pacífico) conjugados en el BFP del objetivo de detección (OB2). Para ayudar en el experimento, se alineó un microscopio de campo brillante con las pinzas ópticas de doble trampa. La iluminación del campo brillante fue proporcionada por un diodo emisor de láser (LED) y monitoreada en tiempo real a través de una cámara de dispositivo de carga acoplada (CCD) (scA640-74fc, Basler). Las dos trampas láser se crearon enfocando dos rayos láser de 1064 nm polarizados ortogonalmente (Fig. 1a) con un objetivo de inmersión en agua de alta transmisión. Las pinzas ópticas de doble trampa pueden ejercer fuerza sobre una sola molécula atada; específicamente, las dos microesferas en la trampa actúan como sensores de fuerza y ​​​​desplazamiento. Los rastros de posición se detectaron a través de dos PSD conjugados al BFP del objetivo de detección con interferometría de plano focal posterior17. Las pinzas ópticas de doble trampa se instalaron dentro de una habitación aislada del ruido ambiental con control de temperatura del pozo y aire acondicionado, específicamente, la fluctuación de temperatura es inferior a 1 °C, mientras que la velocidad del flujo de aire es inferior a 0,1 m/s en la salida de el sistema de aire acondicionado. Para minimizar el ruido de la operación humana y del instrumento ruidoso, el controlador láser con ventilador se movió fuera de la habitación con un haz de fibras multimodo que guía la luz de la bomba hacia la cavidad del láser, y el instrumento se opera, por ejemplo, agregando muestra, formando ataduras, calibración y medición, fuera de la habitación a través de una única interfaz Labview. El instrumento funcionó en modo pasivo de alta resolución, con la ubicación de dos trampas mantenidas estacionarias durante la grabación. Una vez que se requiere un aumento de la fuerza aplicada, la trampa móvil se separa más de la estacionaria a través del piezoespejo. A pesar de ser móvil, el punto del haz en el plano focal posterior de los objetivos es estacionario y su distribución de intensidad depende de la posición de las microesferas atrapadas. Por lo tanto, las pinzas ópticas se pueden calibrar a través de la densidad del espectro de potencia de las señales posicionales,

Aquí, \(\alpha\) es la constante de fuerza, que generalmente oscila entre 0,01 y 0,8 pN/nm en nuestro experimento, la constante de conversión \(c\) está entre 0,1 y 3 mV/nm, y \(\beta =6 \pi r\eta\) es un coeficiente de resistencia conocido. Los experimentos se llevaron a cabo a temperatura ambiente (22 °C) en el tampón HEPES (25 mM de HEPES, NaCl 50 mM, CA630 al 0,02 %, pH 7,4), suplementado con un sistema de eliminación de oxígeno36 (Tabla complementaria 2). La primera suspensión de perlas de poliestireno recubiertas con anticuerpo anti-digoxigenina (diámetro 2,12 \(\mu\)m) se mezcló con una alícuota de la mezcla (mango de ADN reticulado y el complejo SNARE), y la primera perla se mantuvo en el ángulo óptico derecho. trampa; la segunda perla (diámetro 1,76 µm) recubierta con estreptavidina se capturó posteriormente en otra trampa óptica y se acercó a la primera perla para formar la unión proteína-ADN entre dos perlas. Los datos se adquirieron a 20 kHz, se filtraron in situ a 10 kHz y se guardaron en un disco de computadora para su análisis fuera de línea. En el experimento de tracción-relajación, se tensaron (relajaron) complejos SNARE individuales aumentando (disminuyendo) la separación de la trampa a una velocidad constante de 10 nm/s. Para la medición de la dinámica, la separación de las trampas se mantuvo constante para registrar las trazas temporales con transición estocástica.

La extensión del cordón proteína-ADN, \(X\), es la suma de las extensiones del mango de ADN, \({x}_{{DNA}}\), la porción polipeptídica desplegada del complejo SNARE, \ ({x}_{p}\), y la estructura central, h, es decir,

donde \(h\) se supone como la longitud espacial de la porción plegada (como una bobina enrollada) proyectada a lo largo de la dirección de tracción, lo que también contribuye a la extensión final. En el estado completamente plegado (estado nativo), \({h}_{0}=2{{{{\rm{nm}}}}}}\) se determina a partir de la estructura de rayos X de la proteína20, mientras que para el estado completamente desplegado, \(h=0\). Y cuando se tira en dirección axial, \(h=0.15\times {N}_{s}\,{nm}\), donde \({N}_{s}\) es el número de aminoácidos en el porción plegada y es el ascenso helicoidal de un aminoácido a lo largo del eje de la hélice.

Según el experimento, la fuerza de estiramiento \({F}\) y la proteína-ADN manejan la atadura \(X\) entre las caras internas de dos cuentas de poliestireno,

donde \({k}_{{trampa}}=\frac{{k}_{1}{k}_{2}}{{k}_{1}+{k}_{2}}\) es la rigidez efectiva de la trampa, \({R}_{1}\) y \({R}_{2}\) son los radios de dos perlas de poliestireno atrapadas y \(D\) es la separación de la trampa. La fuerza de estiramiento \(F\), la extensión \(X\), los radios de las cuentas \({R}_{1}\) y \({R}_{2}\), la rigidez de la trampa \({ k}_{1}\) y \({k}_{2}\), la longitud del contorno del ADN, \({L}_{{DNA}}=768{{{{{\rm{nm}} }}}}\), y la separación de la trampa \(D\) se puede obtener del experimento.

Para caracterizar el cambio en la longitud del contorno del complejo SNARE-Cpx, se ajustaron trazas de despliegue y replegamiento al modelo de cadena en forma de gusano. Para el mango de ADN, la extensión xDNA en función de la fuerza de estiramiento F está descrita por el modelo de Marko-Siggia37,38,

donde \({P}_{{DNA}}\) y \({L}_{{DNA}}\) son las longitudes persistentes y de contorno del dsDNA, respectivamente, y \({k}_{B}\ ) es la constante de Boltzmann. De manera similar, la fuerza para la porción polipeptídica desplegada del complejo SNARE se puede formular como

donde F y \({x}_{p}\) son la tensión y extensión del polipéptido desplegado respectivamente. La longitud del contorno del polipéptido desplegado \({l}_{p}\) está relacionada con el número N de aminoácidos en el polipéptido, que se describe como \({l}_{p}=0.4\times N\) , donde 0,4 nm es la longitud del contorno cristalográfico por aminoácido39,40. Y \({P}_{P}\) es la longitud de persistencia del polipéptido desplegado. \({k}_{B}T=4.1\,{pN}\cdot {nm}\) es la unidad de energía a temperatura ambiente.

Para caracterizar la vía de plegamiento de las proteínas, el modelo calcula la extensión del complejo SNARE en cada estado. Para cada estado, la extensión consta de dos partes: la extensión del polipéptido desplegado \({l}_{{ir}}\) (i = 1, 2, 3 o 4), que puede calcularse mediante el método Marko- Fórmula de Siggia y la extensión de la porción plegada. Como se describió anteriormente, excepto \({l}_{p}\), \({P}_{{DNA}}\) y \({P}_{P}\), todos los demás parámetros en las ecuaciones . (1)–(4) se pueden obtener experimental o teóricamente. Por lo tanto, podríamos ajustar la extensión experimental al rango de fuerza de cada región (o cada estado) en FEC, para obtener sus valores de mejor ajuste. La adaptación se realiza después de que los FEC se filtren mediante una ventana de tiempo de 11 ms. La longitud de persistencia \({P}_{{DNA}}\) y \({P}_{P}\) son más o menos diferentes para cada molécula, por lo que primero confirmamos estos dos parámetros antes de cada ajuste FEC de cada muestra. La región FEC del estado completamente desplegado se equipa primero con \({P}_{{DNA}}\) (10–50 nm) y \({P}_{P}\) (0,5-0,9 nm) como ajuste parámetros, mientras que la longitud conocida del contorno de la proteína completamente desplegada se toma como parámetro fijo. Luego, los valores \({P}_{{DNA}}\) y \({P}_{P}\) de mejor ajuste se utilizan como parámetros fijos en otras regiones o estados FEC, en los que la longitud del contorno lP es a ser instalados. Por lo tanto, dados los parámetros de longitud de persistencia del ADN y la proteína, la información estructural de las proteínas se puede derivar de la longitud del contorno ajustada del polipéptido desplegado según las Ecs. (2)–(5).

El análisis HMM normalmente se realizó en toda la trayectoria de tiempo de extensión (normalmente duró de 1 a 200 s), después de que la trayectoria se filtró media a 5 kHz o 1 kHz. Evaluamos el número de estados ajustando la distribución del histograma de la extensión con múltiples funciones gaussianas. Luego, los parámetros de ajuste se optimizaron aún más en el HMM con un modelo de transición de cuatro estados utilizando descenso de gradiente. Los análisis HMM arrojaron los parámetros de mejor ajuste correspondientes de las trazas experimentales, como la fuerza de equilibrio y el cambio de extensión.

Los fragmentos o el CpxI completo interactúan con el complejo SNARE, y la traza de extensión del complejo SNARE puede mostrar tres estados diferentes, es decir, el estado C-terminal estabilizado (CT), el estado medio fijado (MC) y el C-terminal. Estado bloqueado (CB). Aquí la probabilidad de cada estado se definió como la velocidad de la señal,

Aquí, \(i={CT},{MC},{CB}\), y CT, MC, CB, representan estados C-terminal estabilizado, medio fijado y bloqueado C-terminal, respectivamente. Esta definición se ha utilizado para procesar la velocidad de la señal en la Fig. 4d y la Fig. 5c en el texto principal. Especialmente, solo había un estado inhibido C-terminal para CpxI 48-73aa en la Fig. 5a.

Porque inyectamos solo tampón (primera columna en la Fig.6a) a través del canal de proteínas como control, y la mayoría (81% de las 31 moléculas analizadas) no mostraron cambios después de la inyección. Y una vez que se inyectó el fragmento 83-134 aa (principalmente parte de CTD, sin CH), 18 de 27 complejos SNARE no mostraron cambios (segunda columna de la Fig. 6a), lo que fue un control negativo de los experimentos en la Fig. 5. En la Fig. 6a, definimos la velocidad de la señal como,

\(i={CT},{MC},{CB},{NC}\). Aquí, CT, MC, CB, NC representan moléculas C-terminales estabilizadas, de sujeción media, C-terminales bloqueadas y sin cambios, respectivamente.

Se aplicó la prueba t pareada para evaluar las estadísticas con un valor p de *p < 0,04, **p < 0,002 y ***p < 10-8. Los tamaños de muestra fueron más de n = 30 muestras biológicamente independientes.

La información de respaldo está disponible en el sitio web del editor.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Los datos que respaldan los hallazgos de este estudio están disponibles del autor correspondiente previa solicitud razonable.

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Agradecemos al Centro Nacional de Ciencias de las Proteínas de Shanghai por el uso del instrumento. TH agradece al Dr. Y. Gao por su ayuda en el ensamblaje SNARE y el experimento de una sola molécula. Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (31571346, 31771432). YR agradece el apoyo de Shanghai y la Universidad de Fudan.

Laboratorio Estatal Clave de Biología Molecular, Instituto de Bioquímica y Biología Celular de Shanghai, Centro para la Excelencia en Ciencia de Células Moleculares, Academia China de Ciencias, Shanghai, 200031, China

Tongrui Hao, Nan Feng y Jiaquan Liu

Universidad de la Academia China de Ciencias, Beijing, 200049, China

Tongrui Hao y Nan Feng

Centro Nacional para la Ciencia de las Proteínas en Shanghai, Laboratorio Zhangjiang, Instituto de Investigación Avanzada de Shanghai, Academia China de Ciencias, Shanghai, 201210, China

Fan Gong y Yang Yu

Instituto de Investigación Traslacional del Cerebro, Facultad de Medicina de Shanghai, Universidad de Fudan, Shanghai, 200032, China

Yu-Xuan Ren

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TH, NF y FG purificaron la proteína y recopilaron los datos de una sola molécula; TH, NF, YY y YR analizaron los datos; YR, FG e YY construyeron el instrumento; JL brindó orientación y apoyo generales; TH y YR redactaron el manuscrito y todos los autores lo revisaron.

Correspondencia a Tongrui Hao, Jiaquan Liu o Yu-Xuan Ren.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Communications Biology agradece a Maria Bykhovskaia y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Editores primarios: Marco Fritzsche y Manuel Breuer. Los informes de los revisores pares están disponibles.

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Hao, T., Feng, N., Gong, F. et al. Ensamblaje regulado por complexina-1 de un único complejo neuronal SNARE revelado mediante pinzas ópticas de una sola molécula. Común Biol 6, 155 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04506-w

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Recibido: 27 de febrero de 2022

Aceptado: 19 de enero de 2023

Publicado: 07 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s42003-023-04506-w

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