Principios del ensamblaje de subunidades pequeñas mitoribosomales en eucariotas.

Nature volumen 614, páginas 175–181 (2023)Cite este artículo

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Los ribosomas mitocondriales (mitoribosomas) sintetizan proteínas codificadas dentro del genoma mitocondrial que se ensamblan en complejos de fosforilación oxidativa. Por tanto, la biogénesis de los mitoribosomas es esencial para la producción de ATP y el metabolismo celular1. Aquí utilizamos microscopía crioelectrónica para determinar nueve estructuras de levaduras nativas y intermediarios del ensamblaje de subunidades pequeñas mitoribosomales humanas, iluminando la base mecanística de cómo se usan las GTPasas para controlar los primeros pasos de la formación del centro de decodificación, cómo se median los eventos iniciales de plegamiento y procesamiento del ARNr, y cómo las proteínas mitoribosomales tienen funciones activas durante el ensamblaje. Además, esta serie de intermediarios de dos especies con arquitectura mitoribosomal divergente descubre principios conservados y adaptaciones específicas de cada especie que gobiernan la maduración de las pequeñas subunidades mitoribosomales en eucariotas. Al revelar la interacción dinámica entre los factores de ensamblaje, las proteínas mitoribosomales y el ARNr necesarios para generar subunidades funcionales, nuestro análisis estructural proporciona una viñeta de cómo la complejidad y diversidad molecular pueden evolucionar en grandes conjuntos de ribonucleoproteínas.

El mitoribosoma, que está presente en las mitocondrias de las células eucariotas, traduce los ARNm mitocondriales que codifican predominantemente componentes de complejos de fosforilación oxidativa. Esta máquina molecular comprende ARNr (12S y 16S en humanos, y 15S y 21S en levaduras) codificados en el genoma mitocondrial que se asocian con proteínas ribosómicas mitocondriales predominantemente codificadas nuclearmente (proteínas mito r) en la matriz mitocondrial para formar el mitoribosoma (55S). en humanos y 74S en levadura). La biogénesis del mitoribosoma requiere factores de ensamblaje de acción trans que acompañan el plegamiento del ARNr y guían la incorporación de la proteína mito-r2,3,4,5,6. El papel central de los mitoribosomas en el metabolismo celular se destaca en varias enfermedades humanas causadas por mutaciones en las proteínas mito r o en los factores de ensamblaje6,7,8,9,10. Por lo tanto, una comprensión estructural de los principios del ensamblaje de mitoribosomas es crucial para definir los fundamentos moleculares de estos procesos y sus enfermedades humanas asociadas.

Aunque el ensamblaje de las subunidades grandes mitocondriales se ha estudiado ampliamente en cinetoplástidos7,8 y células humanas9,10,11,12,13,14, nuestra comprensión estructural del ensamblaje de las subunidades pequeñas mitocondriales (mtSSU) se limita hasta ahora al Trypanosoma brucei15,16, un ejemplo en términos de divergencia evolutiva y etapas tardías del ensamblaje de mitoribosomas de mamíferos17. Actualmente carecemos de conocimientos fundamentales sobre los pasos iniciales del ensamblaje de mtSSU en organismos clave como Saccharomyces cerevisiae y Homo sapiens.

A pesar de la divergencia estructural sustancial entre los ribosomas de varias especies2,3,4,5,6,18,19,20,21, todos los sistemas de ensamblaje de SSU deben superar varios obstáculos comunes en el plegamiento del ARNr para producir subunidades funcionales. Estos incluyen la formación del centro de decodificación, el módulo funcional clave de la SSU, que debe formarse de manera regulada para generar subunidades que muestren una alta fidelidad de traducción. Además, los extremos 5' y 3' del ARNr deben generarse e integrarse en la partícula en maduración. Al mismo tiempo, se debe evitar el compromiso prematuro de los intermediarios del ensamblaje de SSU con subunidades ribosómicas grandes maduras para garantizar un conjunto de ribosomas funcionales. Aunque se han desarrollado diferentes soluciones para estos obstáculos en los sistemas bacterianos y eucariotas22,23, se sabe poco acerca de cómo las células de levadura y humanas logran el control sobre estos pasos iniciales de ensamblaje y cómo estos sistemas han evolucionado para catalizar la formación de SSU mitoribosomales funcionales que son estructuralmente diversas. . Para abordar esto, resolvimos estructuras de alta resolución de seis intermediarios de ensamblaje nativos de células humanas y tres intermediarios de ensamblaje nativos de células de levadura mediante microscopía crioelectrónica (crio-EM), revelando varios principios fundamentales del ensamblaje de mtSSU. En primer lugar, las actividades graduales de los interruptores moleculares controlan los primeros eventos de plegamiento del ARNr que sientan las bases para la formación de un centro de decodificación funcional. En segundo lugar, la integración del extremo 3' del rRNA facilita la compactación del núcleo funcional del rRNA, y los sistemas humanos y de levadura han desarrollado soluciones distintas para hacerlo. En tercer lugar, el reconocimiento y procesamiento del pre-ARNr 5' es una característica única de la vía de ensamblaje de mtSSU de levadura y se lleva a cabo mediante distintos factores de ensamblaje. En cuarto lugar, un factor de ensamblaje conservado organiza la maduración del dominio de la cabeza y previene la participación prematura del ARNm y la subunidad grande mitocondrial. Juntos, estos principios arrojan luz sobre la evolución de las vías de ensamblaje de mtSSU y cómo se utilizan las adaptaciones específicas de cada especie para generar complejidad y diversidad molecular.

Para capturar intermediarios de ensamblaje de mtSSU humano, utilizamos un método de etiquetado bialélico basado en CRISPR establecido para generar una línea celular HEK293F estable que expresa endógenamente el factor de ensamblaje poco conocido METTL17 marcado en el extremo C con proteína verde fluorescente (GFP), y confirmamos que el etiquetado no afectan la traducción mitocondrial 24 (Figura complementaria 2). Los complejos nativos se aislaron mediante purificación por afinidad y la cromatografía líquida con espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS) reveló la presencia de factores mtSSU copurificados y proteínas mito r (Datos complementarios 1). Utilizando crio-EM, identificamos seis estados de ensamblaje discretos (A, B, C, D, E y C*) del mtSSU humano a través de estrategias de clasificación globales y enfocadas y resolvimos sus estructuras con resoluciones que oscilan entre 2,4 y 3 Å (Fig. 1a-e y figuras complementarias 3-19). Estos intermediarios se pueden ordenar en una vía de ensamblaje que racionaliza el estado de maduración de los elementos del ARNr, así como la presencia de factores de ensamblaje y proteínas mito-r. Aunque nuestra asignación de estados A-E sugiere una vía de ensamblaje lineal de intermediarios unidos por METTL17, no podemos excluir la posibilidad de vías alternativas presentes en la célula, incluidas aquellas en las que ciertas proteínas experimentan múltiples ciclos de unión y disociación. En particular, la identificación del estado de ensamblaje C* menos poblado sugiere un desacoplamiento de los mecanismos de ensamblaje de la cabeza y el cuerpo durante la maduración, apoyando la noción de que el ensamblaje de mtSSU no ocurre de manera estrictamente lineal, en línea con las vías de ensamblaje paralelas previamente caracterizadas para bacterias. Conjunto de SSU25 (Figuras complementarias 9 y 18). Estas reconstrucciones revelan las estructuras y funciones de seis factores de ensamblaje en el contexto del ensamblaje: la supuesta metiltransferasa METTL17, las GTPasas NOA1 (refs. 26,27) y ERAL1 (refs. 28,29), la metiltransferasa TFB1M30, la chaperona de ARNr RBFA31. y MCAT (proteína transacilasa portadora de malonil-CoA-acil), una proteína hasta ahora sólo implicada en el metabolismo de los ácidos grasos mitocondriales32.

a – e, Modelos atómicos de cinco intermediarios de ensamblaje de mtSSU humanos a lo largo de la ruta de ensamblaje. Los factores de ensamblaje están coloreados y se observan cambios en la composición de proteínas entre estados. La resolución general de cada reconstrucción crio-EM se indica debajo de cada estado (consulte también las figuras complementarias 2 a 18). f – h, Modelos atómicos de tres intermediarios de ensamblaje de mtSSU de levadura a lo largo de la ruta de ensamblaje. Los factores de ensamblaje están coloreados y se observan cambios en la composición de proteínas entre estados. Para el estado 1 (f), el modelo se muestra con el mapa crio-EM correspondiente filtrado a resolución local. La resolución general de cada reconstrucción crio-EM se indica debajo de cada estado (véanse también las figuras complementarias 20 a 25). La flecha discontinua entre f y g indica múltiples eventos de maduración. Diagramas de estructura secundaria de i, j, rRNA de mtSSU de levadura (i) y humano (j). Los elementos de ARNr, que se ordenan durante la ruta de ensamblaje, se colorean según el estado en el que se ordena el segmento, correspondiendo M a la estructura madura (Protein Data Bank (PDB): 3J9M). El ARNr remodelado se indica mediante hashes y el ARNr procesado se indica mediante puntos.

Para comprender mejor la biogénesis de mtSSU en levadura, purificamos los intermedios de ensamblaje utilizando dos cebos (Figura complementaria 20). Primero, al utilizar el factor específico de levadura Ccm1 (ref. 33) como cebo para la purificación por afinidad, obtuvimos dos intermedios de ensamblaje temprano, estados 1 y 2, que contienen tanto Ccm1 como el homólogo de METTL17 Rsm22 (Fig. 1f, gy Suplementario). Figuras 21, 22 y 24-26). El estado 1 representa el primer intermedio al que le faltan módulos significativos de proteínas mito r y exhibe altos niveles de flexibilidad conformacional en la región de la cabeza. En segundo lugar, purificamos partículas etiquetando Rsm22 y resolvimos la estructura de un intermedio unido a Rsm22, denominado estado 3 (Fig. 1h y Figs. Suplementarias 23-26). El análisis LC-MS/MS de ambos complejos de levadura reveló además la presencia de factores de ensamblaje de mtSSU co-purificados Mtg3 (homólogo del NOA1 humano) y Rmd9, una proteína hasta ahora sólo implicada en la protección de los extremos 3' de los ARNm mitocondriales34,35 ( Datos complementarios 2 y 3 y figura complementaria 20). La presencia de los cuatro factores de ensamblaje (Mtg3, Ccm1, Rmd9 y Rsm22) en un intermedio de ensamblaje adicional también se confirmó mediante LC-MS/MS cuando se usó Mtg3 como cebo para la purificación por afinidad (Datos complementarios 4). Sin embargo, estas partículas no fueron susceptibles de caracterización estructural, presumiblemente debido a una mayor flexibilidad.

Utilizando nuestras estructuras de intermediarios de ensamblaje de mtSSU humanos y de levadura, podemos racionalizar las diferencias en la composición de ARNr y proteína mito-r entre mtSSU de levadura y humanos en el contexto del ensamblaje, mostrando cómo las diferencias se reflejan con mecanismos de ensamblaje locales contrastantes (Datos ampliados, Fig. 1). ). Sin embargo, a pesar de la divergencia significativa en el ARNr mitocondrial en estos organismos, nuestras reconstrucciones resaltan una cronología compartida en la que los segmentos clave de ARNr se remodelan o se ordenan en función de diferentes etapas de ensamblaje (Fig. 1i, j).

El centro de decodificación es la región funcional clave de la SSU, que investiga las interacciones entre ARNm y ARNt para garantizar la fidelidad de la traducción. Por tanto, la formación controlada del centro de decodificación es crítica para el montaje de SSU funcionales. El sistema de ensamblaje humano utiliza dos GTPasas, NOA1 y ERAL1, que actúan como interruptores moleculares que promueven los primeros pasos en la formación del centro de decodificación y la plataforma (Fig. 2). En el estado A, NOA1 regula el acoplamiento de la hélice 44 (h44) a través de dos mecanismos. Primero, una extensión N-terminal de NOA1 bloquea el acceso al sitio de unión de h44 en la cola del mtSSU, que está ocupado por h44 en el estado B (Fig. 2e, f). En segundo lugar, los dominios globulares de NOA1 dificultan el acoplamiento de h44 en la interfaz de la subunidad y al mismo tiempo secuestran a h27 lejos de su posición madura (Fig. 2a y Datos ampliados Fig. 2a, b). La disociación de NOA1 permite el acoplamiento de h44 y su estabilización mediante la unión de un segmento helicoidal de mS38, así como el reposicionamiento de h27 para formar la base de la plataforma (Fig. 2b).

a – d, mapas Cryo-EM de los estados humanos A – D (arriba), con modelos que resaltan la maduración gradual de h44 y el centro de decodificación (abajo). e, Vista ampliada de la región de la cola en el estado A, que muestra cómo la cola N-terminal de NOA1 impide el acoplamiento de h44. f, Vista ampliada de la región de la cola en el estado B, que muestra la acomodación de h44 después de la disociación de NOA1.

Durante el ensamblaje de ribosomas eucariotas y bacterianos, las GTPasas utilizan con frecuencia cambios conformacionales acoplados a la hidrólisis de nucleótidos para promover el ensamblaje direccional de ARNr y módulos de proteínas36,37. Dentro de NOA1, encontramos un sitio de unión a GTP vacante que está parcialmente ocluido por una inserción helicoidal de NOA1, lo que evita que el motivo del interruptor I ocupe una conformación competente para la unión a GTP (Datos ampliados, figura 2d). Dado que la unión de NOA1 a RNA26 y la estimulación de la hidrólisis de GTP mediada por NOA1 mediante ARN se han demostrado previamente27, nuestra estructura de NOA1 en un contexto fisiológico con un mtSSU en maduración proporciona información sobre cómo esta subfamilia de GTPasas, que incluye el factor de ensamblaje de ribosomas bacterianos YqeH, acoplar un ciclo de GTPasa a cambios conformacionales de ARNr en el ensamblaje de SSU mitocondrial y bacteriano37,38.

Junto a NOA1 está la metiltransferasa TFB1M, que tiene un homólogo bacteriano (KsgA), que metila los residuos de adenosina adyacentes en h45 del 16S rRNA39. Además de su papel en la metilación del ARNr, que se analiza en detalle en la siguiente sección, TFB1M cumple un segundo papel durante el ensamblaje de mtSSU como la mitad de una abrazadera molecular con METTL17, que estabiliza un segmento de h44 que interactúa con el ARNm durante la traducción40 (Extended Datos Fig. 3a, b). Además, TFB1M inicialmente secuestra h45, evitando que h45 interactúe y estabilizando la conformación madura de h44 hasta que TFB1M metila dos residuos en h45 y sale durante la transición del estado C al estado D (Fig. 2a – d y Datos ampliados Fig. 3c – mi). Como resultado, esta abrazadera molecular inhibe el plegamiento prematuro de los elementos de ARNr del centro de decodificación y forma un punto de control de ensamblaje en el que se requiere la metilación de h45 para la maduración del centro de decodificación. La disociación de NOA1 y TFB1M durante el ensamblaje genera progresivamente el sitio de unión para mS38, que en el estado D bloquea la orientación relativa de h44, h27 y h45 en una conformación casi madura (Fig. 2a-d). Además, en los estados C y D, los conectores de ARNr que conectan h44 con h45 y h28, que también tienen funciones directas en la decodificación del ARNm durante la traducción, permanecen flexibles debido a la presencia del factor de ensamblaje de unión de ARNr 3' RBFA, como se observa en bacterias23 . Por lo tanto, la interacción funcional entre la GTPasa NOA1, la metiltransferasa TFB1M y la chaperona de ARN RBFA guía y controla la formación del centro de decodificación de modo que el acoplamiento h44, la estabilización y el plegamiento de los conectores de ARNr se produzcan de una manera altamente controlada y gradual.

Los pasos finales en la formación del centro de decodificación requieren el posicionamiento de h31 proximal al sitio P de unión al ARNt. En los estados humanos E y C*, el acceso de h31 al centro de decodificación está bloqueado por el factor de ensamblaje METTL17, un mecanismo que también está presente en el sistema de levadura, y el homólogo de METTL17, Rsm22, realiza la misma función (Datos ampliados, figuras 4a-f). ). Aunque la unión de mS38 humano ocurre de manera progresiva y está presente en los estados B-E, la levadura mS38 aún no está unida en el estado 3, lo que sugiere que la unión de mS38 y los reordenamientos finales en el sitio de decodificación se inician tras la disociación de Rsm22 (Datos ampliados, Fig. 4g-j).

La correcta formación de la plataforma y la integración del extremo 3 'del ARNr de mtSSU es fundamental para la estabilidad del centro de decodificación y, por tanto, crucial para una traducción mitocondrial eficaz. La arquitectura general de la región de la plataforma en el mtSSU humano es similar a la de sus contrapartes citoplasmáticas y bacterianas, con el extremo 3 'del ARNr unido en la parte posterior de la plataforma (Fig. 3a, b). En el mtSSU humano en maduración, el extremo 3 'se estabiliza de manera secuencial y mutuamente excluyente mediante los dos factores de ensamblaje ERAL1 y RBFA, los cuales se conservan entre las mitocondrias humanas y las bacterias. El descubrimiento de ERAL1 dentro de los estados A y B permite una comparación directa con sistemas bacterianos en los que los datos estructurales y bioquímicos disponibles indican que los modos de unión entre ERAL1 mitocondrial y Era bacteriana son similares41. Los estudios bioquímicos de Era bacteriana sugieren además que esta enzima se une al preribosoma en un estado unido a GTP39,40, un principio que probablemente se comparte con el sistema de ensamblaje mitocondrial.

a, Modelo de la arquitectura alrededor del extremo 3' del ARNr en el estado humano B, que ilustra la unión del extremo 3' por ERAL1 y el reclutamiento previo de bS21m. Las flechas resaltan la compactación de la plataforma que se produce entre los estados B y C. b, modelo de la arquitectura alrededor del extremo 3' del ARNr en el estado humano C, que muestra el reposicionamiento del extremo 3' mediante la unión de RBFA y el reclutamiento de un módulo uS11m-h23 a través de bS21m . c, Modelo de la arquitectura de la plataforma en el estado de levadura 1, antes de la incorporación de la mochila y el ARNr 3′ a través de la mochila. El ARNr h45 aún no se ha incorporado a la partícula y la flecha resalta la compactación de la plataforma que se produce entre los estados 1 y 2. d, modelo de la arquitectura de la plataforma en el estado de levadura 2, después del acoplamiento de la mochila y la estabilización del ARNr 3'. En las partes a-d, las proteínas conservadas y los elementos de ARNr comparten los mismos colores. e, Vista lateral del ARNr de la región de la plataforma en el estado humano B. Las flechas muestran el movimiento de los elementos del ARNr que ocurren entre los estados B y C. f, Vista lateral del ARNr de la región de la plataforma en el estado humano C, que revela la compactación de la región, unión de h23 y alojamiento de NAD. g, Vista lateral del ARNr de la región de la plataforma en el estado de levadura 1. Las flechas muestran el movimiento de los elementos del ARNr que ocurren entre los estados 1 y 2. h, Vista lateral del ARNr de la región de la plataforma en el estado de levadura 2, que revela la compactación de la región y el orden de ARNr h23, h24 y h45.

En los estados A y B, ERAL1 se une al extremo 3' del ARNr con un dominio KH C-terminal de manera flexible, con el dominio GTPasa uniéndose a uS7m. En el estado B, la presencia de ERAL1 impide el acoplamiento de h23 y la instalación completa de las proteínas mito r bS21m y uS11m. Como ya se observa un péptido de unión C-terminal de bS21m en el estado B, es probable que este segmento de bS21m sea responsable del acoplamiento inicial y eventual incorporación del módulo bS21m-S11m-h23 en el estado C tras la disociación de ERAL1 (Fig. .3a,b). Una mutación puntual única en el motivo ERAL1 G4 humano da como resultado el síndrome de Perrault, que se caracteriza por sordera neurosensorial y disfunción ovárica, lo que sugiere que esta mutación compromete el ciclo de la GTPasa ERAL1 y, por lo tanto, el ensamblaje de la plataforma mtSSU (Datos ampliados, figuras 5a-c).

Aunque ERAL1 se une de una manera que permite la libertad conformacional del extremo 3' del rRNA, el RBFA se une de manera estabilizadora, intercalando el extremo 3' del rRNA libre entre su dominio KH, un péptido helicoidal N-terminal de RBFA y bS21m (Fig. 3a, b). Este sitio de unión compuesto para el extremo 3 'del ARNr observado aquí es distinto del observado en Escherichia coli, que está formado exclusivamente por RBFA23 (Datos ampliados, figura 6e). La rigidez de la plataforma mediada por bS21m observada entre los estados B y C va acompañada de una compactación concertada del ARNr que da como resultado la formación de un sitio de unión de NAD en la base de la plataforma, que estabiliza una serie de conectores de ARNr monocatenarios en la plataforma (Fig. 3e, f y Datos ampliados Fig. 7). En conjunto, la sustitución de ERAL1 por RBFA, el acoplamiento de h23, uS11m y bS21m, y la unión de NAD ayudan en la compactación orquestada hacia una plataforma rígida.

La compactación gradual de la plataforma tiene consecuencias funcionales para actividades enzimáticas clave. En bacterias, el homólogo de TFB1M, KsgA, media la dimetilación de los residuos de adenosina h45, una actividad que se ha demostrado que es promovida por RBFA31. Aunque no observamos un donante de metilo unido en la enzima, sí observamos residuos objetivo metilados en los estados posteriores a la disociación de TFB1M (estados D y E) (Datos ampliados, figura 3e). Nuestras reconstrucciones proporcionan una justificación estructural para estos datos bioquímicos, lo que sugiere que la actividad de TFB1M está regulada alostéricamente por la estabilidad de la plataforma, que está controlada por los factores de ensamblaje de unión de ARNr 3' ERAL1 y RBFA. Este mecanismo está acoplado a eventos ascendentes en la maduración, ya que un h27 unido a NOA1 impediría la compactación de la plataforma, asegurando que el acoplamiento de h44 se produzca antes de la formación de la plataforma y la metilación de h45. Los eventos de maduración aguas abajo del estado E vinculan posteriormente la función de RBFA y el factor de ensamblaje de etapa tardía METTL15 durante el ensamblaje de mitoribosomas con el inicio de la traducción mediada por mtIF317. Por lo tanto, nuestros datos describen cómo NOA1, ERAL1, RBFA y TBF1M actúan en conjunto para hacer cumplir y coordinar pasos discretos en el ensamblaje y proporcionar un mecanismo unificado para la formación de plataformas y la concesión de licencias de metilación. Dado que todos estos factores son compartidos entre las mitocondrias humanas y las bacterias, este mecanismo probablemente sea compartido entre estas vías de ensamblaje.

Las diferencias clave en la arquitectura del extremo 3 'del ARNr entre el mtSSU humano y el de levadura se reflejan en el mecanismo de estabilización del ARNr 3' durante el ensamblaje. La mtSSU de levadura contiene un ARNr 3 'extendido, que llega hasta la parte posterior de la subunidad y está unido por un conjunto de proteínas mito-r específicas de levadura (mS42 y mS43) en un módulo que denominamos mochila (Fig. 3d y Datos ampliados Fig. 1g). Nuestros datos bioquímicos que indican que la proteína de unión a ARN Rmd9 también funciona como un factor de ensamblaje de mitoribosomas son consistentes con la observación de que su agotamiento desestabiliza el 15S rRNA42 (Datos complementarios 2-4). La extensión de ARNr 3 'en la levadura contiene una secuencia (5′-AAUAUUCUU-3') que coincide parcialmente con un motivo que es una secuencia reconocida específicamente por Rmd9 (ref. 35). Estos datos sugieren que Rmd9 puede estar involucrado en la maduración del extremo 3 'del ARNr 15S de la levadura en un intermedio de ensamblaje temprano y probablemente conformacionalmente dinámico. La presencia de un ARNr 3' extendido, mS42 y mS43, y la ausencia de RBFA o ERAL1 en S. cerevisiae sugiere que la estabilización del extremo 3' ocurre de una manera distinta en comparación con los sistemas humanos y bacterianos. De acuerdo con esta idea, este módulo de mochila y h45 son flexibles y no están resueltos en el estado 1, mientras que en el estado 2, estos elementos se han acoplado a la partícula (Fig. 3c, d). El acoplamiento del módulo de mochila y la estabilización del ARNr 3 'da como resultado una compactación de la plataforma y un ordenamiento del ARNr similar al observado en humanos (Fig. 3g, h). Dada la forma única en que las proteínas mito r de levadura mS42 y mS43 estabilizan el extremo 3 'del ARNr 15S desde el estado 2 en adelante, parece que estas proteínas mito r han reemplazado funcionalmente los factores de ensamblaje humanos ERAL1 y RBFA. En lugar de la estabilización controlada del ARNr 3 'mediada por ERAL1 y RBFA humanos, que está acoplada a la actividad TFB1M, las proteínas mito-r de levadura mS42 y mS43 median el acoplamiento y la estabilización del ARNr 3' mientras permanecen unidas en el mtSSU maduro. En conjunto, estos datos ilustran el vínculo entre la estabilización del extremo 3 'y la maduración de la plataforma y muestran cómo el ARNr y la expansión de la proteína mito-r que se produjo a través de la evolución en la levadura se acomodan en el sistema de ensamblaje de la levadura.

A diferencia de los ARN mitoribosomales humanos, que están salpicados de ARNt que se escinden y procesan postranscripcionalmente para liberar ARNr de "longitud completa", los ARNr de levadura deben ser procesados por exonucleasas para generar subunidades maduras43. En los estados 1 y 2, la proteína de repetición pentatricopeptídica Ccm1 se localiza en el precursor 5 'del ARNr 15S en una posición que posteriormente ocupa mS47 tanto en el estado 3 como en la levadura madura mtSSU (Fig. 4a, b). El sitio de unión y la función observada de Ccm1 explican datos bioquímicos previos que implican a esta proteína en la estabilización del 15S rRNA33. Ccm1 utiliza el reconocimiento de ARN de estructura y secuencia específica, uniéndose a una región monocatenaria del precursor y reconociendo específicamente las bases −6 a −1 (Fig. 4c). Por lo tanto, Ccm1 se encuentra en una posición única para acompañar el pre-ARNr mitocondrial de manera cotranscripcional de manera similar a los factores de ensamblaje de ribosomas eucarióticos que se unen a otros elementos precursores 5 '44. El intercambio de Ccm1 por mS47 está acoplado a la eliminación irreversible del ARNr precursor que se acompaña de cambios conformacionales de las proteínas mito r uS5m y mS26m, y un ordenamiento adicional de un conector flexible de mS45 en el estado 3 que previamente estaba ausente en el estado 2. (Figuras 4a,b). Estos cambios conformacionales señalan la finalización del procesamiento del ARNr del extremo 5' mediante la protección del extremo 5' maduro del ARNr 15S y la estabilización de mS47 en el estado 3. La eliminación del precursor 5' junto con la disociación de Ccm1 está catalizada al menos en parte. por la exoribonucleasa 5′-3′ Pet127, que ha sido previamente implicada en el procesamiento del ARNr 15S y del ARNm mitocondrial45. De acuerdo con su papel en el procesamiento del pre-ARNr, encontramos que la eliminación del gen que codifica Pet127 da como resultado la acumulación del precursor 5' y también afecta la asociación tanto de los activadores traduccionales de una pequeña cantidad de ARNm mitocondriales como del ensamblaje de mtSSU. factores con mtSSU y sus precursores purificados a través de la proteína mito r de unión temprana etiquetada uS17m (Figura complementaria 27 y Datos complementarios 5). Juntos, nuestros datos estructurales y bioquímicos muestran que Ccm1 y Pet127 coordinan el procesamiento controlado del extremo 5 'del ARNr mitocondrial de levadura.

a, Modelo de Ccm1 y el precursor 5′ en el estado 2. Las flechas indican cambios conformacionales de las proteínas mito-r durante la transición del estado 2 al 3. b, Modelo de la misma región en a, pero en el estado 3. c , Modelo de Ccm1 unido al ARNr precursor 5' (arriba) y un dibujo de la estructura secundaria de la secuencia precursora 5' (abajo), coloreado como en el modelo: la región roja es reconocida específicamente por Ccm1, las regiones naranjas están resueltas. y las regiones grises no se resuelven.

El dominio principal de la SSU ribosómica es responsable de la unión de ARNm y ARNt durante la traducción. Nuestras reconstrucciones revelan cómo los factores de ensamblaje promueven transformaciones graduales de ARNr y elementos proteicos en la región de la cabeza de mtSSU. Un factor de ensamblaje conservado clave dentro de las mitocondrias, que utiliza impedimento estérico durante la maduración de la región de la cabeza, es la supuesta metiltransferasa Rsm22 (METTL17 en humanos). Tanto en el sistema humano como en el de levadura, Rsm22 (METTL17) se une a la interfaz de los dominios de la cabeza y el cuerpo, ocluyendo el canal de ARNm y evitando la compactación del dominio de la cabeza hacia el cuerpo (Fig. 5a, e). La presencia de este factor en los intermediarios del ensamblaje enfatiza su papel central como guardián contra la unión prematura del ARNm en etapas anteriores del ensamblaje, lo que se combina con su función de secuestrar h31, uno de los últimos elementos del centro de decodificación en ser ubicado (Datos extendidos). Figuras 4c-f). Además, hemos identificado un grupo Fe4S4 como un cofactor arquitectónico de la familia de proteínas Rsm22 (METTL17), que racionaliza los datos estructurales previos obtenidos en cinetoplástidos, así como las interacciones genéticas entre METTL17 y la maquinaria de biogénesis del grupo hierro-azufre15,46 (Datos ampliados, Fig. 8a-c). La unión de METTL17 a h31 también previene la asociación del factor de ensamblaje de etapa tardía METTL15, que solo se observa en intermediarios de ensamblaje con un dominio de cabeza maduro17. Estos eventos imponen una cronología del ensamblaje de mtSSU humano en la que la formación y compactación de la cabeza preceden a la modificación final del centro de decodificación mediada por METTL15. El papel arquitectónico de METTL17 y su posición en la vía de ensamblaje aguas arriba de METTL15 explicarían aún más los defectos de metilación del ARNr observados en células deficientes en METTL1747.

a, Modelo del estado humano D, que destaca la inhibición de la unión del ARNm a través de METTL17. b – d, Vista ampliada de arriba hacia abajo del dominio de la cabeza en el estado intermedio del ensamblaje humano D (b), el estado E (c) y la estructura madura de preiniciación (PDB: 6RW4) (d). e, Modelo del estado de levadura 2, que destaca la inhibición de la unión del ARNm a través de Rsm22. f – h, Vista ampliada de arriba hacia abajo del dominio de la cabeza en el estado intermedio 2 (f) del ensamblaje de la levadura, el estado 3 (g) y la estructura madura (PDB: 5MRC) (h). Entre los paneles se observan la unión y disociación de factores proteicos que ocurren entre estados. En todos los paneles, los elementos de proteína y ARNr conservados comparten los mismos colores, y las flechas de colores muestran cambios conformacionales en el ARN o elementos proteicos que ocurren durante el ensamblaje.

Nuestras estructuras muestran que en humanos, METTL17 organiza la maduración del ARNr de la cabeza mediante la interacción con un factor de ensamblaje adicional identificado en este estudio: MCAT (Fig. 5a-d). En los estados A a D, la presencia de ambos factores evita la compactación del dominio de ARNr principal 3', separando los elementos de ARNr y los módulos de proteínas para permitir una flexibilidad significativa entre módulos. Además de impedir estéricamente el plegado y acoplamiento de h42, que forma una tapa a lo largo de la parte superior del dominio de la cabeza, MCAT secuestra h31, un segmento de ARNr principalmente monocatenario que emana de h30 y h32, desde el núcleo del dominio de la cabeza (Fig. 5a,b). Tras la salida de MCAT en el estado E, h42 puede ordenarse en la posición previamente ocupada por MCAT y h31 puede adoptar una conformación compacta formando contactos con h34, h42 y h43 (Fig. 5c). Por tanto, la disociación de MCAT desencadena la compactación global del dominio principal 3 '. La identificación de MCAT como un factor de ensamblaje de mtSSU genuino recontextualiza la observación de que las mutaciones en esta proteína causan neuropatía óptica similar a LHON32. Varias mutaciones en el ADNmt que codifican subunidades de complejos de la cadena respiratoria también están asociadas con este trastorno, lo que sugiere que los defectos funcionales de estas mutaciones MCAT se derivan de su papel como factor de ensamblaje de mtSSU en lugar de su papel en el metabolismo de los ácidos grasos (Datos ampliados, figuras 5d-f). ).

Aunque la levadura carece de un homólogo de MCAT, la mtSSU de levadura tiene dos proteínas mito-r adicionales presentes en el mismo lugar donde se une MCAT en humanos, lo que sugiere que pueden acompañar el acoplamiento de h42 temprano en el ensamblaje. Aunque Rsm22 también previene la compactación de la cabeza en la levadura, a diferencia de sus homólogos en los sistemas humano y T. brucei, la levadura Rsm22 ha perdido la capacidad de unión a SAM pero ha conservado el pliegue general de la metiltransferasa (Datos ampliados, figuras 8a-c). Un segmento peptídico helicoidal C-terminal de uS10m inicialmente previene la unión de mS46, la proteína mito r final que se une al dominio de la cabeza. Posteriormente, la disociación de Rsm22 impulsa la reorientación de h33 y el reposicionamiento de este péptido para permitir la unión de mS46 y la maduración completa del dominio de la cabeza (Fig. 5g, h).

En los sistemas de ensamblaje de mtSSU tanto de levadura como de humanos, la maduración del dominio de la cabeza implica factores de ensamblaje que actúan para impedir estéricamente los reordenamientos discretos en el ARNr y el orden conservado de los elementos de la proteína r mito para promover el empaquetamiento del ARNr (Datos ampliados, figuras 8d-g). En la levadura, los elementos proteicos como uS10m parecen haber evolucionado para tener un papel activo durante el ensamblaje de mtSSU al prevenir los reordenamientos del ARNr y la asociación de la proteína mito-r, al tiempo que se convierten en constituyentes permanentes de la subunidad madura. Esta trayectoria evolutiva hacia funciones duales de las proteínas mito r en la levadura es similar a las adaptaciones observadas para la unión, estabilización e incorporación del extremo 3 'del ARNr, en las que los factores de ensamblaje utilizados en sistemas humanos y bacterianos se intercambian por mito r-. Proteínas que se unen a un segmento extendido de ARNr.

Un desafío fundamental durante la formación de SSU ribosómicas es el correcto ensamblaje de regiones de ARNr funcionalmente críticas, como el centro de decodificación. Hacerlo de manera controlada y regulada es esencial para la generación de subunidades funcionales que exhiban una alta fidelidad traduccional para controlar la calidad de las proteínas recién sintetizadas. Para los mitoribosomas, este aspecto de la regulación del ensamblaje es especialmente crucial dado que sus productos de traducción, subunidades de complejos de fosforilación oxidativa, son esenciales para crear ATP en condiciones aeróbicas. Aquí hemos resuelto estructuras de SSU mitoribosomales humanas y de levadura que se ensamblan en condiciones nativas. Además de descubrir características arquitectónicas clave de estas subunidades premitoribosomales e iluminar el papel de los factores de ensamblaje en la regulación de la formación de elementos de ARNr, hemos mostrado cómo los mecanismos y la maquinaria de ensamblaje han evolucionado para resolver obstáculos compartidos durante el ensamblaje entre estos dos organismos modelo. Figura 6).

a, b, Esquema de las vías de ensamblaje de mtSSU humana (a) y de levadura (b). Los corchetes centrales indican temas comunes en ambos sistemas de ensamblaje, mientras que los corchetes exteriores indican soluciones de ensamblaje evolutivamente divergentes. Se muestran los eventos de unión y disociación del factor de ensamblaje. Las flechas discontinuas indican múltiples eventos de maduración17.

En el sistema de ensamblaje humano, hemos demostrado que los factores de ensamblaje en conjunto con las proteínas mito-r catalizan la formación y estabilización gradual de elementos de ARNr antes de los estados observados previamente17. En particular, una red de factores de ensamblaje (NOA1, ERAL1, RBFA, TFB1M y METTL17) combinan la maduración del centro de decodificación con la compactación de la plataforma y la estabilización del ARNr del extremo 3', en el proceso que autoriza la metilación de residuos clave en h45 en el momento correcto durante montaje (Fig. 6a). Aunque el mecanismo de estabilización del extremo 3 'en la levadura es distinto del de los humanos, ya que requiere proteínas mito-r únicas para unirse y acoplarse a un extremo 3' de ARNr extendido en lugar de factores de ensamblaje de unión del extremo 3' dedicados como se observa en el sistema humano. Mostramos que la incorporación estable del extremo 3 'del ARNr es un punto de control clave en el ensamblaje de mtSSU (Fig. 6b). De manera similar, la levadura utiliza una vía distinta de maduración del ARNr en el extremo 5 'que involucra un factor de ensamblaje único y proteínas mito-r específicas de la levadura. Por el contrario, la arquitectura compartida y el papel de Rsm22 (METTL17) en la prevención de la unión del ARNm, la compactación de subunidades y la formación del centro de decodificación demuestra un nivel de conservación entre estos dos sistemas de ensamblaje, un concepto que se destaca además por las similitudes en la cronología de plegamiento del ARNr (Figs. .1i,j y 6). Además, observamos que nuestro estudio proporciona una vista estructural de los intermedios de ensamblaje que pueden asociarse con Rsm22 (METTL17), visualizando así una línea de ensamblaje de lo que probablemente sea un panorama de ensamblaje ramificado que involucra factores de ensamblaje que se disocian y reasocian en uniones clave.

Las similitudes y diferencias que se muestran aquí ilustran cómo diferentes mecanismos moleculares que involucran factores de ensamblaje dedicados y proteínas mito-r bifuncionales han evolucionado para resolver obstáculos comunes durante el ensamblaje. Estos principios resaltan el acoplamiento evolutivo entre el mecanismo de ensamblaje y la arquitectura final de grandes complejos biomoleculares multiméricos, y arrojan luz sobre el surgimiento de la complejidad molecular y la diversidad entre especies.

Para generar una línea celular de mamífero estable con METTL17 etiquetado endógenamente en ambos alelos, utilizamos una plataforma de edición del genoma previamente desarrollada en el laboratorio y utilizada para la purificación de pre-ribosomas humanos llamada SNEAK PEEC (kit asistido por fluorescencia de superficie diseñada con captura mejorada de epítopos de proteínas) 24. Este sistema utiliza la escisión del genoma de Cas9 dirigida por ARN guía y la expresión de epítopos de la superficie celular en el marco para permitir la identificación de clones editados bialélicamente mediante clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS). Los plásmidos plantilla de reparación contienen brazos de homología de 600 pb que flanquean el sitio de corte de Cas9 ubicado en el último exón de METTL17 y un inserto en el marco que contiene la etiqueta de afinidad (linker-twinStrep-FLAG-10xHis-TEV-SPOT-3C-GFP) y uno de los dos epítopos de la superficie celular diseñados (la proteína de unión a vitamina B12 Btuf de E. coli (PDB: 5OVW) y la proteína de la cápside p24 del virus de la inmunodeficiencia humana 1 (PDB: 5O2U)) separados por un sitio T2A48,49.

Para generar estas plantillas de reparación, se clonaron brazos de homología que flanquean el sitio objetivo de Cas9 y un sitio de clonación múltiple en la estructura principal de pUC57 (GenScript). La secuencia de inserción completa, incluida la etiqueta de afinidad, el sitio T2A y los epítopos de visualización de la superficie, se introdujeron utilizando los sitios NotI y PacI en el sitio de clonación múltiple. El plásmido para la expresión de ARN guía único y Streptococcus pyogenes Cas9 (variante eSpCas9(1.1)) se derivó del plásmido Addgene n.º 71814, un regalo de F. Zhang50. La secuencia objetivo de ARN guía única de 20 pb (5′-GTTTCCTCCATCTACGGCTC-3', PAM: CGG) se diseñó usando crispor.telfor.net51 y se clonó en este vector usando sitios BbsI.

Se cultivaron células HEK293F (R79007, Thermo Fisher Scientific) en placas de 24 pocillos (353047, Falcon) en medio de expresión Freestyle 293 (12338026, Thermo Fisher Scientific) suplementado con suero bovino fetal (FBS) inactivado por calor al 2%. Las líneas celulares no fueron analizadas para detectar micoplasmas. Cada pocillo se transfectó utilizando 1 µg de ADN total (ambos plásmidos plantilla de reparación y el plásmido Cas9/ARN guía único en concentraciones equimolares) con aproximadamente un 90 % de confluencia utilizando el reactivo de transfección Lipofectamine 2000 (11668019, Thermo Fisher Scientific) en 500 µl de Opti- Medio MEM (31985070, Thermo Fisher Scientific). Doce horas después de la transfección, las células se lavaron y se resuspendieron en medio de expresión Freestyle 293 suplementado con FBS al 2% inactivado por calor. Después de la recuperación, las células se expandieron en placas de seis pocillos (10062-892, VWR) y se pasaron en el transcurso de 14 días.

Para preparar las células para la citometría de flujo, las células se recolectaron de placas de seis pocillos mediante aspiración suave, se lavaron en PBS 1X con BSA al 0,1% y se resuspendieron en PBS 1X con BSA al 0,1% hasta una concentración de 1 a 10 x 106 células por mililitro. A continuación, se agregaron a suspensiones celulares dos nanocuerpos marcados con fluorescencia, cada uno de los cuales se une específicamente a uno de los epítopos expresados en la superficie celular, a una concentración de 10 nM. La reacción de marcaje se llevó a cabo en la oscuridad durante 30 minutos en hielo antes de lavar las células dos veces con PBS 1X con BSA al 0,1%. Luego, las células se resuspendieron en 200 µl de PBS 1X con BSA al 0,1 % y se filtraron directamente antes de la clasificación de las células para eliminar los grupos de células (352235, BD Falcon). La clasificación de células se llevó a cabo utilizando un clasificador de células BD FACSAria (BD Biosciences) utilizando el software FACSDiva (BD Biosciences). Se utilizó DAPI para teñir las células muertas directamente antes de clasificarlas. Los controles de compensación de un solo color necesarios, incluida GFP y cada nanocuerpo marcado individualmente, se realizaron directamente antes de clasificar las células experimentales utilizando células HEK293F que expresan GFP o epítopos de la superficie celular de plásmidos. Para identificar células METTL17 marcadas bialélicamente, primero se clasificaron las células para identificar las células positivas para GFP, seguido de una segunda selección para aislar las células que se tiñeron positivamente para los epítopos de superficie btuF y p24. El análisis de los datos se realizó utilizando FlowJo (FlowJo, LLC).

Los clones unicelulares se clasificaron en placas de 96 pocillos que contenían 200 µl de medio de expresión Freestyle 293 (12338026, Thermo Fisher Scientific) suplementado con 2% de FBS inactivado por calor por pocillo. Después de 2 semanas de expansión clonal, los clones individuales se examinaron mediante dos PCR para confirmar la edición bialélica. El ADN genómico se aisló utilizando la solución de extracción de ADN QuickExtract (QE09050, Lucigen) según el protocolo del fabricante. De la solución extraída, se usaron 30 µl por PCR (volumen de reacción final de 50 µl) usando los siguientes cebadores de PCR:

Para la reacción 1, adelante: 5′-TATGTGTTCACAGTGTCCCCATGAACTCCC-3' (cebador genómico recocido aguas arriba del brazo de homología izquierdo METTL17); reverso: 5′-GACTCCACGGGGCCAACTGTCTCAAGG-3 ′ (epítopo específico de BtuF).

Para la reacción 2, adelante: 5′-TATGTGTTCACAGTGTCCCCATGAACTCCC-3' (cebador genómico recocido aguas arriba del brazo de homología izquierdo METTL17); reverso: 5′-TGCTGTCATCATTTCCTCGAGCGTAGCACC-3′ (epítopo específico del VIH p24).

Posteriormente, se cultivaron células METTL17 HEK293F marcadas bialélicamente en suspensión en medio de expresión Freestyle 293 a 37 °C con 80 % de humedad y 8 % de CO2, agitando a 135 rpm.

La cepa BY4741 de S. cerevisiae (MATa his3Δ leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0) se utilizó como punto de partida para la construcción de cepas marcadas endógenamente. Todas las cepas se cultivaron aeróbicamente a 30 °C en medio YPG (1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 3% de glicerol). Los intermedios de ensamblaje de S. cerevisiae mtSSU se purificaron a partir de tres cepas BY4741 genéticamente modificadas: la primera cepa que contenía un MTG3 etiquetado con GFP C-terminal escindible en 3C (MATa his3Δ leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 MTG3-linker-3c-GFP::ClonNat), el segunda cepa que contiene una CCM1 etiquetada con mCherry C-terminal escindible con proteasa TEV y una MTG3 etiquetada con GFP C-terminal escindible 3C (MATa his3Δ leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 MTG3-linker-3c-GFP::ClonNat CCM1-linker-tev-mCherry: :HphMX4), y la tercera cepa que contiene una etiqueta de péptido alfa escindible por proteasa 3C en tándem C-terminal y una etiqueta peptídica alfa escindible por TEV en RSM22 (MATa his3Δ leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 RSM22-linker-tev-alfa tag-3C-mCherry::ClonNat) .

Para comparar los complejos mitoribosomales en entornos de tipo salvaje y PET127-knockout (KO), se adquirió una cepa PET127-KO de la colección Yeast Knockout (YKO) de Horizon Discovery (MATa his3Δ leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 PET127::kanMX6). Las cepas de tipo salvaje y PET127-KO se modificaron para contener un US17M etiquetado con GFP C-terminal escindible por proteasa TEV (MATa his3Δ leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 US17M-linker-tev-GFP::HphMX4, MATa his3Δ leu2Δ0 met15Δ0 ura3Δ0 PET127::kanMX6 US17M-linker-tev-GFP::CloNat).

Todas las cepas se generaron aplicando técnicas estándar de etiquetado genómico. Se detallan los cebadores utilizados para el etiquetado genómico de levaduras: cebador directo Ccm1: AAAAGTCACACGCAAAAGGCCCTGAAGTGGGAGGAACAAGAACTTAACATGACGCTGCAGGTCGACGGATCC; Cebador inverso Ccm1: GAGCTTTTATTTACAGGCGCTTTACTATATATATATATGTGCATGCATGGGGCAGATCCGCGGCCGCATAGG. Cebador directo Mtg3: TGGTTCAACACCTAGAAAAAAAAAAAGAATCCCTATTGGTACTACCAATGGACGCTGCAGGTCGACGGATCC; Cebador inverso de Mtg3: TGAATATACTTTGTTCCCAACTTTCTTTTTAGTTTACTTACATTCATATTGGCAGATCCGCGGCCGCATAGG. Cebador directo Rsm22: AATTGTCCACTTTTCACGGCAACGATTTTTTTACAACATGTAAATAGAAAAACGCTGCAGGTCGACGGATCC; Cebador inverso Rsm22: CAAACTGTACTATATATATATCATATTCACGTATGTAGAATATTAAAGTAGGCAGATCGCGGCCGCATAGG. cebador directo uS17m: AAAATTTGTTAAGAAAGCACGTCATGATGGATATGCAACAACCAAGCCAGACGCTGCAGGTCGACGGATCC; Cebador inverso uS17m: TACTATTTACGTAACGAAGTCTTGTAGTTGTATATATTTACAGAGTGTAGGGCAGATCCGCGGCCGCATAGG.

Las cepas descritas se cultivaron aeróbicamente a 30 °C en medio YPG (1% de extracto de levadura, 2% de peptona y 3% de glicerol) hasta una densidad óptica a 600 nm de 1,5–2. Las células se recogieron a 4000 g durante 5 minutos, se lavaron una vez con 1 l de ddH2O helada y una vez con un volumen de ddH2O suplementado con inhibidores de proteasa (E64, pepstatina y PMSF) igual a la masa del sedimento celular. El sedimento final se congeló instantáneamente en nitrógeno líquido y (si se usó para una purificación compleja) se lisó mediante criomolienda usando un molino planetario de bolas Retsch PM100. El polvo criomolido se almacenó a –80 °C o se utilizó inmediatamente.

Se cultivaron células METTL17 HEK293F marcadas bialélicamente en suspensión en medio de expresión Freestyle 293 a 37 °C con 80 % de humedad y 8 % de CO2, agitando a 135 rpm. De las células, se cultivaron 3,2 l hasta 3,0 x 106 células por mililitro y se recogieron mediante centrifugación a 2.000 g (JLA 8.100, Beckman Coulter). Las células se lavaron en PBS 1X enfriado con hielo, se dejaron caer en N2 líquido y se congelaron a -80 °C hasta su uso. La purificación mitocondrial cruda se completó utilizando un protocolo adaptado de la ref. 52. Todos los pasos se completaron en hielo usando tampones preenfriados a 4 °C, y todos los pasos de centrifugación se completaron a 4 °C. Las células congeladas se resuspendieron en tampón hipotónico helado (HEPES-KOH 20 mM, pH 7,5, KCl 5 mM, MgCl2 1,5 mM y con inhibidores de proteasa 1X (E64, pepstatina y PMSF)) en una proporción de 1 ml g-1 de congelado. material. Las células se hincharon durante 10 minutos antes de transferir la resuspensión a un homogeneizador Dounce. Luego, las células se lisaron con 15 golpes de mortero B. Se añadió tampón MSH 2,5X (manitol 525 mM, sacarosa 175 mM, HEPES 20 mM, pH 7,5 con inhibidores de proteasa 1X (E64, pepstatina y PMSF)) a una concentración 1X. Luego, el lisado se eliminó mediante dos rondas de centrifugación a 1300 g durante 5 minutos para sedimentar los restos celulares. Luego se hizo girar el sobrenadante a 15.000 g durante 15 minutos (JA 25,50) para sedimentar las mitocondrias. Las mitocondrias crudas se lavaron con tampón MSH 1X y se resuspendieron en tampón de resuspensión mitocondrial (HEPES-KOH 25 mM, pH 7,5, KCl 100 mM, Mg(OAc)2 25 mM y Triton X-100 al 1% v/v con inhibidores de proteasa 1X (E64). , pepstatina y PMSF)) en una proporción de 1 ml por 2,5 g de material congelado. Las mitocondrias se lisaron durante 30 min a 4 °C con mezcla constante y el lisado se aclaró mediante centrifugación a 17.000 g durante 20 min (JA 25,50, Beckman Coulter). De perlas anti-GFP preequilibradas (Chromotek), se agregaron 30 µl al sobrenadante y se incubaron durante 3 h a 4 °C con mezcla constante. Las perlas se lavaron dos veces con tampón de resuspensión mitocondrial y una vez con tampón de lavado (HEPES-KOH 25 mM, pH 7,5, KCl 100 mM y Mg(OAc)2 25 mM con inhibidores de proteasa 1X (E64, pepstatina y PMSF)). Luego, las perlas se resuspendieron en 40 µl de tampón de elución (HEPES-KOH 25 mM, pH 7,5, KCl 100 mM, Mg(OAc)2 25 mM y C12E8 al 0,005%) y se eluyeron mediante la adición de proteasa 3C durante 1 h en hielo. Los complejos eluidos se utilizaron inmediatamente para la preparación de la rejilla, con análisis por LC-MS o SDS-PAGE.

Las rejillas se prepararon utilizando un robot Vitrobot Mark IV (FEI Company) a 95% de humedad. De la solución compleja eluida, se aplicaron 3,5 µl a un Quantifoil Au R3.5/1 descargado con luz con una capa de carbono ultrafino de 2 nm (LFH7100AR35, Electron Microscopy Sciences). La rejilla se incubó durante 2,5 minutos dentro de la cámara Vitrobot antes de secar manualmente el exceso de solución. Luego se volvieron a aplicar 3,5 µl de muestra fresca antes de otra incubación de 2,5 minutos y transferencia manual. Se completó una aplicación final de muestra de 3,5 µl y una incubación de 2,5 minutos antes de secar con una fuerza de transferencia de 8, un tiempo de transferencia de 8 y sumergir en etano líquido. Se tomaron imágenes de las cuadrículas en un microscopio electrónico Titan Krios (FEI) con un filtro de energía (ancho de rendija de 20 eV) y un detector K3 Summit (Gatan) que opera a 300 kV con un aumento nominal de ×64,000. Se utilizó SerialEM53 para recopilar un conjunto de datos por un total de 37.047 micrografías con un rango de desenfoque de −0,7 a −1,8 µm y un tamaño de píxel de superresolución de 0,54 Å. Las micrografías contenían 42 fotogramas utilizando una dosis total de 28,5 e− por píxel por segundo con un tiempo de exposición de 2,1 s, lo que resultó en una dosis total de 51 e− Å−2. Utilizando una estrategia de disparos múltiples, se recolectaron nueve micrografías por hoyo y se tomaron imágenes de cuatro hoyos en cada posición del escenario. Se recopiló un segundo conjunto de datos que comprende 9.990 micrografías en la misma cuadrícula en diferentes orificios utilizando una estrategia de recolección diferente en la que se tomaron imágenes de nueve orificios en cada posición del escenario, utilizando el mismo rango de desenfoque, dosis de electrones y recuento de fotogramas. Estos conjuntos de datos se denominan conjunto de datos 1 (37 047 micrografías) y conjunto de datos 2 (9990 micrografías) en las figuras complementarias y siguientes.

Todos los pasos del procesamiento crio-EM se completaron utilizando RELION 3.1.1 (ref. 54) a menos que se indique lo contrario, y se resumen en las figuras complementarias. 3–18. Para cada conjunto de datos, las imágenes se corrigieron, se ponderaron por dosis, se alinearon y se agruparon en un tamaño de píxel de 1,08 Å utilizando la implementación de MotionCor2 en RELION55, y el desenfoque de la micrografía se estimó utilizando GCTF1.18 (ref. 56). Se generó un modelo inicial para la clasificación 3D utilizando un subconjunto de prueba de 2597 micrografías del conjunto de datos 1 de la siguiente manera: se entrenó CrYOLO57 y se usó para seleccionar 533 056 partículas de estas micrografías, y estas partículas se extrajeron a 8,64 Å por píxel (8 × agrupación) . Después de la clasificación 2D (K = 100 y T = 2), se eligieron de forma conservadora seis clases, que se asemejaban a diferentes vistas del mtSSU maduro, lo que dio como resultado 65.174 partículas, que posteriormente se volvieron a extraer con un tamaño de píxel de 4,32 Å por píxel (4 × agrupamiento). Estas partículas se utilizaron para generar un modelo inicial ab initio. Este modelo inicial se utilizó como referencia para la clasificación 3D con alineación global de un segundo conjunto de 333.265 partículas de la clasificación 2D, que se seleccionaron de forma menos conservadora y se volvieron a extraer a 2,16 Å por píxel (agrupación 2×). Dos clases resultantes, que comprenden el 80% de los datos y 268.009 partículas, se combinaron y refinaron a 4,36 Å. Esta reconstrucción se utilizó como referencia para la clasificación de todo el conjunto de datos.

CrYOLO se entrenó de forma independiente en cada conjunto de datos y se utilizó para seleccionar partículas de todas las micrografías, lo que dio como resultado 7.597.700 partículas para el conjunto de datos 1 y 1.511.635 partículas para el conjunto de datos 2. Estas partículas se extrajeron a 8,64 Å por píxel (8 veces agrupación) y el conjunto de datos 1 se dividió. en cuatro subconjuntos con 1.894.925 partículas cada uno. Para limpiar la pila de partículas, cada subconjunto, así como todas las partículas del conjunto de datos 2, se sometieron a una clasificación 2D (K = 100 y T = 2) seguida de una clasificación 3D con alineación (K = 5 y T = 4; 25 iteraciones con Muestreo angular de 7,5°, 10 iteraciones con muestreo angular de 3,7° y 10 iteraciones con muestreo angular de 1,8°). Se combinaron buenas clases de cada clasificación 3D y se eliminaron duplicados, lo que dio como resultado un total de 1.927.789 partículas, y las partículas de cada conjunto de datos tenían diferentes grupos ópticos. A diferencia del conjunto de datos de prueba, las partículas seleccionadas comprendían aproximadamente solo el 40% de las partículas de cada subconjunto. Para garantizar que se seleccionaran todas las partículas buenas, todas las partículas de las clases inicialmente no seleccionadas se combinaron y se volvieron a extraer a 4,32 Å por píxel (agrupación 4x), totalizando 4.015.406 partículas. Estas partículas se dividieron en dos subconjuntos de 2.007.700 partículas cada uno y se sometieron a una segunda ronda de clasificación 3D con alineación (K = 5 y T = 4; 25 iteraciones con muestreo angular de 7,5°, 10 iteraciones con muestreo angular de 3,7° y 10 iteraciones con muestreo angular de 1,8°). Se combinaron buenas clases y se eliminaron duplicados, lo que dio como resultado 1.183.364 partículas, que se fusionaron con la selección inicial de 1.927.789 partículas. Después de eliminar duplicados, se volvió a extraer una pila de partículas final con 2.575.411 partículas a 1,08 Å por píxel (agrupación 1×), se refinó y se sometió a pulido bayesiano y refinamiento de la función de transferencia de contraste (CTF). Un refinamiento posterior dio como resultado un mapa de consenso de 2,45 Å.

Para determinar la heterogeneidad compositiva y conformacional presente en el mapa de consenso, se utilizó una clasificación 3D sin alineación. Los intentos iniciales se realizaron sin máscara, lo que resultó en clases con diferentes orientaciones relativas entre los dominios de la cabeza y el cuerpo, lo que refleja la libertad conformacional del dominio de la cabeza. Sin embargo, esta estrategia no fue óptima para distinguir diferencias de composición en los datos, especialmente aquellas presentes en las regiones del cuerpo, la plataforma y la cabeza. Como resultado, se realizó una clasificación 3D sin alineación (K = 10 y T = 30) con una máscara alrededor del dominio corporal, lo que resolvió con éxito la heterogeneidad composicional presente. Se identificaron cuatro clases, que representaban intermedios de ensamblaje de composición única. De los datos, el 10% (263.184 partículas) representan el estado más temprano en el que se desplaza h44, la densidad de NOA1 y TFB1M está presente y la plataforma está menos ordenada. Denotamos este estado intermedio A. De los datos, el 19% (497,031 partículas) representan el siguiente estado, en el que h44 está presente y NOA1 está ausente, pero la plataforma aún está remodelada y TFB1M está presente, como en el estado A. Denotamos este estado intermedio B. De los datos, el 10% (262,363 partículas) representan un estado en el que la plataforma está bien ordenada y TFB1M está presente. Denotamos este estado intermedio C. De los datos, el 27% (697.003 partículas) representan un estado en el que TFB1M no está presente y la plataforma está bien ordenada. Denotamos este estado intermedio como D. Cada uno de estos estados fue sometido a otra ronda de refinamiento CTF y pulido bayesiano, refinado y posteriormente procesado de forma independiente.

Para caracterizar estructuralmente completamente estos intermediarios, adoptamos una estrategia que utiliza clasificación enfocada y/o refinamiento enfocado para mejorar las resoluciones locales de regiones flexibles, como las ocupadas por factores de ensamblaje, la cabeza y la plataforma. En particular, el dominio de la cabeza exhibe una libertad conformacional significativa en relación con el dominio del cuerpo, como se observa en otras reconstrucciones de SSU ribosómicas. Para cada estado, se utilizó un refinamiento enfocado para realinear las partículas en el dominio de la cabeza, lo que reveló una remodelación significativa del ARNr debido a la presencia de los factores de ensamblaje METTL17 y MCAT. Los módulos resultantes exhiben una flexibilidad relativa adicional, lo que limita aún más la resolución de estas regiones. Para abordar esto, el dominio principal de cada estado se sometió a una clasificación 3D enfocada sin alineación para identificar un subconjunto de partículas con módulos bien definidos antes de la clasificación enfocada y/o el refinamiento enfocado de módulos individuales. Para los estados C y D, esta clasificación dio como resultado la identificación de pequeños subconjuntos de datos en los que MCAT está ausente y h42 está estabilizado en una conformación casi madura (Figuras complementarias 6c y 7d). Denotamos estos estados como estado C* y estado E, respectivamente, y procesamos adicionalmente estas partículas de forma independiente (Figuras complementarias 8 y 9). Proponemos que el estado C* representa un intermedio de una vía secundaria en la que la disociación de MCAT ocurre antes de la disociación de TFB1M (omitiendo así el estado D), mientras que el estado E representa un intermedio que sigue directamente al estado D y al estado C*. Todos los refinamientos enfocados se realizaron mediante aplanamiento con solvente y las resoluciones informadas se basan en el criterio estándar FSC (Fourier Shell Correlation) -0.143 calculado durante el posprocesamiento en RELION. Las resoluciones locales de mapas enfocados se calcularon en RELION.

Para proporcionar una visión completa del proceso de ensamblaje, explotamos la superposición en los mapas del cuerpo y la cabeza para generar mapas compuestos y los modelos correspondientes que representan la conformación relativa predominante entre estos dominios. Los mapas enfocados se ajustaron y se volvieron a muestrear en los mapas generales en Chimera58 y posteriormente se combinaron para crear mapas compuestos usando phenix.combine_focused_maps59. También se combinaron medios mapas de cada refinamiento enfocado utilizando el mismo procedimiento. Luego, las composiciones se redimensionaron a un tamaño de píxel calibrado de 1,062 Å por píxel y se calcularon las resoluciones generales en RELION. Se utilizó cryoSPARC60 para calcular la resolución local de mapas compuestos y generar mapas filtrados por resolución local. Se utilizó el servidor de procesamiento remoto 3D-FSC para calcular curvas 3D-FSC para mapas compuestos61.

Para los estados humanos, se utilizó un modelo inicial que incluía todas las proteínas ribosómicas y el ARNr 12S (PDB: 6RW4) como plantilla inicial para la construcción del modelo mediante el acoplamiento de cuerpos rígidos en mapas compuestos. Para construir factores de ensamblaje, se utilizó como modelos iniciales una combinación de modelos de homología generados en la base de datos AlphaFold (NOA1, METTL17, RBFA y ERAL1) y estructuras de rayos X existentes (MCAT (PDB: 2C2N) y TFB1M (PDB: 6AAX)). antes del ajuste manual usando COOT62. Los cambios en la conformación del ARN se tuvieron en cuenta en cada estado mediante refinamiento manual en COOT62. Finalmente, se ajustaron modelos completos para cada estado con tres ciclos de refinamiento en PHENIX usando phenix.real_space_refine utilizando restricciones de estructura secundaria59. Debido a la menor resolución local para el dominio ERAL1 KH, recortamos las cadenas laterales en esta sección de la cadena a Cβ después del refinamiento de todos los átomos. Las estadísticas de refinamiento de modelos para modelos humanos se pueden encontrar en la Tabla de datos ampliados 1.

Los mapas y modelos se visualizaron en Chimera58, ChimeraX63 y PyMol (Schrödinger, LLC).

Las figuras se generaron usando ChimeraX63. Las sesiones de PyMol están disponibles para cada estado individualmente y con todos los estados juntos.

El polvo de levadura criomolido se resuspendió en tampón A (HEPES-KOH 25 mM, pH 7,5, KCl 100 mM, MgOAc 25 mM, Triton X-100 al 0,1%, DTT 2 mM, PMSF, pepstatina y E64) y se aclaró mediante centrifugación a 4ºC. °C y 40.000g durante 20 min. El lisado aclarado se incubó con perlas de NHS-sefarosa (Cytiva) acopladas a nanocuerpos anti-mCherry durante 3 horas a 4 °C en un nutador. Las perlas se sedimentaron mediante centrifugación a 4 °C durante 1 min a 127 g. Después de tres lavados en tampón A, los complejos inmovilizados se incubaron con proteasa 3C a 4 °C durante 1 h. Después de la escisión de la proteasa, el sobrenadante se aplicó a perlas de NHS-sefarosa (Cytiva) acopladas a nanocuerpos anti-alfa y se incubó en tampón B (HEPES-KOH 25 mM, pH 7,5, KCl 100 mM y MgOAc 25 mM) durante 1,5 h a 4 °. C. Posteriormente, las perlas se lavaron tres veces en tampón B y el complejo se eluyó en el mismo tampón, suplementado con proteasa TEV.

Las rejillas se prepararon utilizando un robot Vitrobot Mark IV (FEI Company) al 100% de humedad. Para el conjunto de datos Ccm1, se aplicaron 3,5 µl de solución compleja eluida a un Quantifoil Au R3.5/1 con descarga luminosa con una capa de carbono ultrafino de 2 nm (LFH7100AR35, Electron Microscopy Sciences). La rejilla se incubó durante 1 minuto dentro de la cámara Vitrobot antes de secar manualmente el exceso de solución. Luego se volvieron a aplicar 3,5 µl de muestra fresca antes de otra incubación de 1 minuto y transferencia manual. Se completó una aplicación final de muestra de 3,5 µl y una incubación de 1 minuto antes de agregar CHAPSO a CMC (8 mM). Luego se secó la rejilla (fuerza de transferencia de 8 y tiempo de transferencia de 8 s) y se sumergió en etano líquido.

Para el conjunto de datos Rsm22, se aplicaron 3,5 µl de solución compleja eluida a una rejilla Quantifoil Au R3.5/1 con descarga luminosa con una capa de carbono ultrafino de 2 nm (LFH7100AR35, Electron Microscopy Sciences). La rejilla se incubó durante 2,5 minutos dentro de la cámara Vitrobot antes de agregar CHAPSO a CMC (8 mM). Luego se secó la rejilla (fuerza de transferencia de 8 y tiempo de transferencia de 3,5 s) y se sumergió en etano líquido.

Se tomaron imágenes de las cuadrículas en un microscopio electrónico Titan Krios (FEI) con un filtro de energía (ancho de rendija de 20 eV) y un detector K3 Summit (Gatan) que opera a 300 kV con un aumento nominal de ×64,000. Se utilizó SerialEM53 para recopilar dos conjuntos de datos por un total de 31.995 (Ccm1) y 14.111 (Rsm22) micrografías con un rango de desenfoque de −1 a −2,5 µm y un tamaño de píxel de superresolución de 0,54 Å. Las micrografías contenían 40 fotogramas utilizando una dosis total de 36 e-por píxel por segundo (tamaño de píxel de la muestra de 1,08 Å por píxel) con un tiempo de exposición de 2 s y una dosis total de 61,73 e- Å-2. Se utilizó una estrategia de múltiples disparos diferente para cada conjunto de datos. Para el conjunto de datos Ccm1, se utilizó una estrategia de múltiples disparos con nueve micrografías recolectadas por hoyo y se tomaron imágenes de nueve hoyos en cada posición de una sola etapa. Para el conjunto de datos Rsm22, se recolectaron diez micrografías por orificio y se tomaron imágenes de cuatro orificios en cada posición de la etapa.

Todos los pasos del procesamiento crio-EM se completaron utilizando RELION 3.1.1 (ref. 54) a menos que se indique lo contrario, y se resumen en las figuras complementarias. 21–25. Para cada conjunto de datos, las imágenes se corrigieron, se ponderaron por dosis, se alinearon y se agruparon en un tamaño de píxel de 1,08 Å utilizando la implementación MotionCor2 en RELION55, y el desenfoque de la micrografía se estimó utilizando GCTF1.18 (ref. 56).

Para los intermedios mtSSU asociados a Ccm1, se generó un modelo inicial para la clasificación 3D utilizando un subconjunto de prueba de 8.189 micrografías de la siguiente manera: CrYOLO57 fue entrenado y utilizado para seleccionar 830.061 partículas de estas micrografías, y estas partículas se extrajeron a 4,32 Å por píxel. (4× agrupamiento). Después de dos rondas de clasificación 2D (K = 100 y T = 2), se eligieron de forma conservadora cuatro clases, que se asemejaban a diferentes vistas del mtSSU maduro, lo que dio como resultado 23.206 partículas. Estas partículas pasaron por dos rondas de reconstrucción ab initio en crioSPARC60. El refinamiento de 7.263 partículas seleccionadas en crioSPARC permitió la generación de un modelo inicial ab initio.

CrYOLO fue entrenado y utilizado para seleccionar partículas de todas las micrografías, lo que dio como resultado 3.286.640 partículas. Estas partículas se extrajeron a 4,32 Å por píxel (agrupación 4×) y se dividieron en 5 subconjuntos con 357.328 partículas cada uno. Para limpiar la pila de partículas, cada subconjunto se sometió a una clasificación 3D con alineación (K = 5 y T = 4; 25 iteraciones con muestreo angular de 7,5°, 10 iteraciones con muestreo angular de 3,7° y 10 iteraciones con muestreo angular de 1,8°). Se combinaron buenas clases de cada clasificación 3D y se eliminaron duplicados, lo que dio como resultado 316.817 partículas en total. Estas partículas se volvieron a extraer a 1,08 Å por píxel (agrupación 1×), se refinaron y se sometieron a pulido bayesiano y refinamiento CTF. Un refinamiento posterior dio como resultado un mapa de consenso de 3,13 Å. Para identificar estados conformacionalmente distintos en los datos, se realizaron dos rondas de clasificación 3D sin alineación (K = 3 y T = 50) con una máscara alrededor del dominio del cuerpo. Se identificaron dos clases distintas, que representaban intermedios de ensamblaje de composición única. Ambos estados contienen un precursor 5 ′ unido al factor de ensamblaje de mtSSU Ccm1. 19.730 partículas representan el estado más temprano en el que la plataforma está desordenada y un grupo de proteínas ribosómicas, que llamamos mochila (bS1m, uS2m, mS23, mS37, mS42 y mS43), que se unen al extremo 3′ del ARNr 15S son ausente. Nos referimos a este intermedio como estado 1. 54.519 partículas representan un estado posterior en el que la plataforma está bien ordenada y las proteínas de mochila están unidas. Denotamos este intermedio como estado 2. Cada uno de estos estados fue refinado y posteriormente procesado de forma independiente.

Para los intermedios mtSSU asociados a Rsm22, se generó un modelo inicial para la clasificación 3D utilizando un subconjunto de prueba de 3982 micrografías de la siguiente manera: CrYOLO fue entrenado y utilizado para seleccionar 891,434 partículas de estas micrografías, y estas partículas se extrajeron a 4,32 Å por píxel. (4× agrupamiento). Después de la clasificación 2D (K = 100 y T = 2), se seleccionaron 17 clases, que se parecían a diferentes vistas del mtSSU maduro, lo que dio como resultado 635.817 partículas. Estas partículas pasaron por una reconstrucción ab initio en crioSPARC, lo que permitió la generación de un modelo inicial ab initio.

CrYOLO se entrenó y utilizó para seleccionar partículas de todas las micrografías, lo que dio como resultado 3.544.843 partículas, que se extrajeron a 8,64 Å por píxel (8× agrupamiento). Para limpiar la pila de partículas, todas las partículas se sometieron a una clasificación 2D (K = 100 y T = 2) seguida de una clasificación 3D con alineación (K = 5 y T = 4; 20 iteraciones con muestreo angular de 7,5°, 10 iteraciones con muestreo angular de 3,7° muestreo angular y 10 iteraciones con muestreo angular de 1,8°). Se combinaron buenas clases de esta clasificación, lo que dio como resultado 1.656.825 partículas en total. Estas partículas se volvieron a extraer a 1,08 Å por píxel (agrupación 1×), se refinaron y se sometieron a pulido bayesiano y refinamiento CTF. Un refinamiento posterior dio como resultado un mapa de consenso de 2,84 Å. Del mapa de consenso quedó claro que había una flexibilidad considerable en el dominio principal de este subconjunto de partículas. Para visualizar esta región, se realizó una clasificación 3D sin alineación (K = 3 y T = 50) con una máscara alrededor del dominio de la cabeza. Se combinaron dos buenas clases de este estado y se sometieron a pulido bayesiano, refinamiento CTF y refinamiento 3D, lo que dio como resultado un mapa de 2,65 Å. Para caracterizar estructuralmente completamente este intermedio, utilizamos el refinamiento multicuerpo con máscaras alrededor de los dominios de la cabeza y el cuerpo, lo que resultó en dos mapas separados. Esto mejoró la resolución local, sobre todo en el dominio principal. Las resoluciones informadas de estos mapas se basan en el criterio estándar de oro FSC-0.143 calculado durante el posprocesamiento en RELION. La resolución local de los mapas enfocados se calculó en RELION.

Explotamos la superposición en los mapas del cuerpo y la cabeza para generar mapas compuestos y modelos correspondientes que representan la conformación relativa predominante entre estos dominios para cada estado individual. Los mapas enfocados se ajustaron y se volvieron a muestrear en los mapas generales en Chimera58 y posteriormente se combinaron para crear mapas compuestos usando phenix.combine_focused_maps59. También se combinaron medios mapas de cada refinamiento enfocado o refinamiento multicuerpo utilizando el mismo procedimiento. Luego, las composiciones se redimensionaron a un tamaño de píxel calibrado de 1,057 Å por píxel y se calcularon las resoluciones generales en RELION. Se utilizó crioSPARC para calcular la resolución local de mapas compuestos y generar mapas filtrados por resolución local. Se utilizó el servidor de procesamiento remoto 3D-FSC para calcular curvas 3D-FSC para mapas compuestos61.

Para los estados de levadura, se utilizó un modelo inicial que incluía todas las proteínas ribosómicas y el ARNr 15S (PDB: 5MRC) como plantilla inicial para la construcción del modelo mediante el acoplamiento de cuerpos rígidos en mapas compuestos. Para construir factores de ensamblaje, se utilizaron modelos de homología de Rsm22 y Ccm1 generados con Alphafold64 como modelos iniciales antes del ajuste manual con COOT62. Los cambios en la conformación del ARN se tuvieron en cuenta en cada estado mediante refinamiento manual en COOT62. Finalmente, se ajustaron modelos completos para cada estado con tres ciclos de refinamiento en PHENIX usando phenix.real_space_refine utilizando restricciones de estructura secundaria59. Debido a la menor resolución local de Rsm22 en el estado 1, recortamos las cadenas laterales de esta proteína a Cβ después del refinamiento de todos los átomos, excluyendo los residuos esenciales para la coordinación del grupo hierro-azufre. Las estadísticas de refinamiento de modelos para modelos de levadura se pueden encontrar en la Tabla de datos ampliados 2.

Los mapas y modelos se visualizaron en Chimera58, ChimeraX63 y PyMol (Schrödinger, LLC). Las figuras se generaron usando ChimeraX63. Las sesiones de PyMol están disponibles para cada estado individualmente y con todos los estados juntos.

El ARN celular total se extrajo de 0,2 g de células de levadura congeladas después de la lisis mediante batido de perlas en 1 ml de TRIzol (Ambion). Para el análisis de los estados de procesamiento previo al ARNr mediante transferencia Northern, se cargaron 3 μg de ARN celular total en cada carril de un gel desnaturalizante de formaldehído-agarosa al 1,2% (SeaKem LE, Lonza) y se separaron a 75 V durante 3 h. Después de la ejecución, el ARN separado se transfirió a una membrana de nailon cationizado (Zeta-Probe GT, Bio-Rad) mediante transferencia capilar descendente y se reticuló a la membrana para el análisis de transferencia Northern mediante irradiación UV a 254 nm con una exposición total de 120 mJ·cm. −2 en un UV Stratalinker 2400 (Stratagene).

Antes de la adición de sondas de oligonucleótidos de ADN marcadas con el extremo γ-32P, las membranas reticuladas se incubaron con tampón de hibridación (NaCl 750 mM, citrato trisódico 75 mM, SDS al 1% (p/v), dextrano al 10% (p/v). sulfato y formamida al 25% (v/v)) durante 30 min a 65 °C. Las sondas de hibridación marcadas se incubaron con la membrana primero a 65 °C durante 1 h y luego a 37–45 °C durante la noche. Las membranas transferidas se lavaron una vez con tampón de lavado 1 (NaCl 300 mM, citrato trisódico 30 mM y SDS al 1% (p/v)) y una vez con tampón de lavado 2 (NaCl 30 mM, citrato trisódico 3 mM y SDS al 1% (p/v). ) SDS) durante 30 minutos cada uno a 45 °C, antes de leer la señal radiactiva mediante la exposición de las membranas lavadas a una pantalla de fósforo de almacenamiento, que posteriormente se escaneó con un generador de imágenes de modo variable Typhoon 9400 (GE Healthcare). Las secuencias de las sondas de oligonucleótidos fueron las siguientes: 15S, GTTTACTACTAGAACTACACGGGTATCG; Precursor 5 ′, ATTTTTTACTTTTCCTTATTATA.

Las muestras de ribonucleoproteína purificadas se secaron y se disolvieron en urea 8 M, bicarbonato de amonio 0,1 M y DTT 10 mM. Después de la reducción, las cisteínas se alquilaron en yodoacetamida 30 mM (Sigma). Las proteínas se digirieron con LysC (endoproteinasa LysC, Wako Chemicals) en menos de 4 M de urea, seguido de tripsinación (tripsina dorada, Promega) en menos de 2 M de urea. Las digestiones se detuvieron añadiendo TFA, y los digestos se desalinizaron65 y se analizaron mediante nano-LC-MS/MS de fase reversa utilizando un Fusion Lumos (Thermo Scientific). Los datos se cuantificaron y buscaron en la base de datos de proteínas Uniprot de S. cerevisiae o H. sapiens (2019) concatenada con la secuencia de la proteína MS2 y contaminaciones comunes. Para la búsqueda y cuantificación se utilizó MaxQuant v2.0.3.0 (ref. 66). La oxidación de la metionina y la acetilación N-terminal de la proteína se permitieron como modificaciones variables y todas las cisteínas se trataron como carbamidometiladas. Se habilitó la opción "coincidencia entre ejecuciones" y las tasas de descubrimiento falso de proteínas y péptidos se establecieron en 1% y 2%, respectivamente.

Para la EM comparativa, las abundancias de proteínas se expresaron como valores de cuantificación sin etiquetas. Los datos se analizaron utilizando Perseus (v1.6.10.50)67. En resumen, los valores de cuantificación sin etiquetas se transformaron log2 seguido de un filtrado que requería que una proteína coincidiera en las tres réplicas para al menos una condición. Se llevó a cabo una prueba t de Student bilateral para confirmar la significación estadística de los datos.

Todos los datos de MS están disponibles en los Datos complementarios 1 a 5.

Para determinar si la traducción mitocondrial está comprometida en células marcadas con METTL17-GFP, se resuspendieron sedimentos de células HEK293F de tipo salvaje y METTL17-GFP en tampón de lisis (HEPES-KOH 25 mM, pH 7,5, KCl 100 mM, Mg(OAc)2 25 mM). y Triton X-100 al 1%, con inhibidores de proteasa 2X (E64, pepstatina y PMSF)) y se lisaron durante 30 min a 4 °C. El lisado se eliminó a 17.000 g durante 20 minutos a 4 °C y la concentración de proteína total se determinó mediante el kit de ensayo de proteínas Bio-Rad. Se separaron cantidades iguales de proteína total (20 μg) mediante SDS-PAGE y se transfirieron a una membrana de difluoruro de polivinilideno antes de bloquear en TBS-T con leche desnatada al 5% durante 1 hora a temperatura ambiente. Luego, la membrana se incubó con anticuerpo primario en TBS-T con leche desnatada al 3 % durante 2 h a temperatura ambiente en las siguientes diluciones: MT-CO1 (clon 1D6E1A8, n.º de cat. 459600, Thermo Fisher Scientific) para 1:1000, MT -ND1 (clon 5J5C8, n.º de cat. MA5-42939, Thermo Fisher Scientific) para 1:1000 y β-actina (n.º de cat. PA1-183, Thermo Fisher Scientific) para 1:2000. Luego, la membrana se lavó tres veces en TBS-T antes de la incubación con el correspondiente anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP): IgG anti-conejo de cabra conjugada con HRP (n.º de catálogo 111-035-003, Jackson ImmunoResearch) o HRP-T. IgG anti-ratón de cabra conjugada (n.º de catálogo 115-035-003, Jackson ImmunoResearch) en una dilución de 1:5000 en TBS-T con leche desnatada al 3 %. Luego, la membrana se lavó dos veces en TBS-T y una vez en TBS antes de obtener imágenes en un generador de imágenes Typhoon 9400 (GE) utilizando el reactivo de detección ECL Prime (Amersham).

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen del informe de Nature Portfolio vinculado a este artículo.

Las micrografías crio-EM sin procesar se han depositado en el Archivo de imágenes públicas de microscopía electrónica: EMPIAR-11313. Los mapas crio-EM y los modelos atómicos se han depositado en el Banco de Datos de Microscopía Electrónica (EMDB) y el PDB, respectivamente: estado A (EMD-26966 y 8CSP), estado B (EMD-26967 y 8CSQ), estado C (EMD -26968 y 8CSR), estado D (EMD-26969 y 8CSS), estado E (EMD-26970 y 8CST), estado C* (EMD-26971 y 8CSU), estado 1 (EMD-27249 y 8D8J), estado 2 ( EMD-27250 y 8D8K) y estado 3 (EMD-27251 y 8D8L).

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Descargar referencias

Agradecemos a M. Ebrahim, J. Sotiris y H. Ng del Centro de recursos de microscopía crioelectrónica Evelyn Gruss Lipper de la Universidad Rockefeller por su ayuda con el análisis de cuadrículas y la recopilación de datos; S. Mazel del Centro de Recursos de Citometría de Flujo de la Universidad Rockefeller por su ayuda con la clasificación de células individuales durante la generación de líneas celulares humanas; A. Vanden Broeck por sus consejos sobre el procesamiento de datos crio-EM y guiones para figuras; y miembros del laboratorio Klinge por la lectura crítica de este manuscrito. Los datos de MS fueron generados por el Proteomics Resource Center de la Universidad Rockefeller (RRID: SCR_017797) utilizando instrumentación financiada por la Sohn Conferences Foundation y Loena M. and Harry B. Helmsley Charitable Trust, y agradecemos particularmente a H. Molina, S. Heissel. y C. Peralta por su ayuda. Este estudio fue financiado, en parte, por la subvención de capacitación NIH T32 5T32GM136640-02 (a NJH). y por la Fundación Robertson (a SK).

Estos autores contribuyeron igualmente: Nathan J. Harper, Chloe Burnside

Laboratorio de Química de Proteínas y Ácidos Nucleicos, Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, EE. UU.

Nathan J. Harper, Chloe Burnside y Sebastián Klinge

Programa Triinstitucional de Capacitación en Biología Química, Universidad Rockefeller, Nueva York, NY, EE. UU.

Nathan J. Harper y Chloe Burnside

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SK concibió el estudio. NJH, CB y SK diseñaron los experimentos y analizaron los datos. NJH realizó todos los experimentos en células humanas, incluida la generación de líneas celulares, la purificación compleja, el procesamiento de datos crio-EM y la construcción de modelos. CB realizó todos los experimentos en células de levadura, incluida la generación de cepas, la purificación compleja, el procesamiento de datos crio-EM, la construcción de modelos y la transferencia Northern. Todos los autores escribieron y editaron el manuscrito.

Correspondencia a Sebastian Klinge.

La Universidad Rockefeller ha presentado una patente relacionada con la plataforma de edición del genoma humano utilizada en este estudio, en la que se nombra a SK como inventor. Todos los demás autores no declaran tener intereses en competencia.

Nature agradece a Joaquín Ortega y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Modelos de: (a) proteínas mitoribosomales humanas no presentes en levaduras en el contexto de la subunidad madura (PDB:3J9M)21 (b) proteínas mitoribosomales de levadura y ARNr no presentes en humanos en el contexto de la subunidad madura (PDB:5MRC)19. Los segmentos de ARNr únicos son de color blanco a menos que la región sea funcionalmente relevante dentro de los estados de ensamblaje capturados en este estudio. (c) factores de ensamblaje humano identificados en este estudio. (d) factores de ensamblaje de levadura identificados en este estudio. Para los anuncios de paneles, las imágenes inferiores incluyen cuadros que describen las regiones etiquetadas de interés para los paneles, eh. (e) el dominio principal cerca de METTL17/Rsm22 en los estados D y E (humano) y el estado 3 y la estructura madura (levadura, PDB:5MRC)19. En los seres humanos, la proteína única mS31 se une a la proteína única mS39. En la levadura, un segmento único de ARNr, h33, es acomodado por la proteína única mS46 después de la disociación de Rsm22. El factor de ensamblaje humano MCAT, que carece de un homólogo de levadura, puede ser reemplazado funcionalmente por levaduras uS13m y uS19m. (f) proteínas que alojan el ARNr 5 'en el estado A (humano) y los estados 2 y 3 (levadura). El módulo de unión central conservado formado por uS5m se aumenta en levadura para integrar el precursor 5' y Ccm1 a través de las proteínas específicas de levadura uS4m, mS45 y mS47. (g) proteínas involucradas en la estabilización de 3 'en los estados B y C (humano) y el estado 3 (levadura). En humanos, los factores de ensamblaje de unión 3' dedicados ERAL1 y RBFA estabilizan el ARNr 3' durante el ensamblaje. En la levadura, el ARNr 3' se extiende y se aloja mediante un módulo de mochila que incluye las proteínas únicas mS42, mS43 y una extensión mS23. (h) proteínas involucradas en el acoplamiento de h44 en los estados A y B (humano) y el estado 3 (levadura). Las proteínas humanas específicas mS27 y mS34 permiten la inhibición mediada por NOA1 del acoplamiento de h44, mientras que h44 en la levadura está unido a la proteína de levadura mS44. Para los paneles eh, las proteínas conservadas y los segmentos de ARNr entre los dos sistemas de ensamblaje tienen colores idénticos.

(a) Red de interacción de NOA1 en el Estado A en contexto con todo el complejo (izquierda), mostrado en caricatura (derecha) y en un esquema (abajo). (b) Modelo y mapa crio-EM de la región resaltada en verde en (a). (c) Análisis de conservación de la región peptídica N-terminal de NOA1 (izquierda) y contexto molecular, mostrado como modelo y densidad crio-EM. (d) Modelos del dominio GTPasa de GTPasa YqeH permutada circularmente relacionada (izquierda, PDB:3EC1)38 en comparación con NOA1 (derecha). Los motivos de GTPasa conservados están coloreados y etiquetados. Los reordenamientos propuestos de NOA1 que ocurren durante la unión de GTP se muestran como flechas. Análisis de conservación de la inserción helicoidal en el dominio GTPasa (derecha).

(a) Red de interacción de TFB1M en el Estado C en contexto con todo el complejo (izquierda), mostrado en caricatura (derecha) y en un esquema (abajo). ( b ) Modelos y mapas crio-EM que muestran la actividad de sujeción de TFB1M h44. ( c ) Modelos y mapas crio-EM que muestran el sitio activo enzimático que carece de densidad para la S-adenosil metionina donante de metilo. (d) Comparación del modo de unión de h45 entre TFB1M y su homólogo bacteriano KsgA (PDB:7O5H)39. ( e ) Comparación de la densidad crio-EM h45 entre el Estado C y el Estado D, que muestra cambios conformacionales y apariencia de densidad correspondiente a residuos de adenosina modificados. Los mapas de ambos estados se muestran al mismo nivel del contorno.

(a) Estructura general del estado de levadura 3. Los cuadrados negros y rojos indican la ubicación de los paneles cyd y gj, respectivamente. (b) Estructura general del Estado humano E. El cuadrado negro indica la ubicación de los paneles e y f. (c) Modelo de h31 unido por Rsm22, como se observa en el Estado 3. La flecha gris denota el movimiento relativo del ARNr hacia el centro de decodificación debido a la compactación de la subunidad después de la disociación de Rsm22. (d) Misma vista que (c) en la estructura del mitoribosoma de N. crassa durante la traducción (PDB:6YWY)68, que muestra las interacciones de h31 con el ARNm y el ARNt del sitio P. (e) Modelo de h31 unido por METTL17, como se observa en el estado E. La flecha gris denota el movimiento relativo del ARNr hacia el centro de decodificación debido a la compactación de la subunidad después de la disociación de METTL17. (f) Misma vista que (e) en la estructura del mitoribosoma de H. sapiens durante la traducción unido a los ARNt de los sitios A, P y E (PDB:6ZSG)40, que muestra las interacciones de h31 con el ARNm y el ARNt del sitio P. . En los paneles cf, los modelos están alineados en h31. (g – j) Cronología de los estados de levadura 1 a 3 y la estructura madura (PDB:5MRC) 19 con el mapa gaussiano asociado filtrado a 1,4 desviaciones estándar superpuestas. Obsérvese la ausencia de h45 en el Estado 1 y de mS38 en los estados intermedios del ensamblaje 1 a 3.

(a) Modelo del Estado B destacando el contexto de ERAL1 durante el montaje. (b) Ubicación del mutante N236I implicado en el síndrome de Perrault en el sitio de unión a GTPasa de ERAL129. (c) Misma vista que (b) en el Estado C, que muestra las transiciones estructurales asociadas con el intercambio ERAL1/RBFA. (d) Modelo de Estado D destacando el contexto del MCAT durante la asamblea. (e) Ubicación de las mutaciones MCAT L81R, R212W y E347K implicadas en la neuropatía óptica similar a LHON32. (f) Misma vista que (e) en el Estado E, que muestra transiciones estructurales asociadas con la disociación MCAT. En los paneles b, c, eyf, se anotan las propiedades de los elementos de ARNr locales dentro de cada estado.

(a) Red de interacción de la RBFA en el Estado C en contexto con todo el complejo (izquierda), que se muestra en una caricatura (derecha) y en un esquema (abajo). ( b ) Modelo y mapa crio-EM de la región resaltada en (a), que muestra el sitio de unión compuesto formado por RBFA y bS21m. ( c ) Análisis de conservación del segmento peptídico N-terminal que se observa que interactúa con bS21m durante la unión del ARNr 3 '. (d) Modelo que ilustra los cambios conformacionales en uS7m durante el intercambio RBFA/ERAL1 en los Estados B y C. (e) Comparación del modo de unión del ARNr 3' entre sistemas humanos y bacterianos (PDB:7BOH)23.

(a,b) Elementos de ARNr involucrados en la estabilización de la plataforma durante la transición entre el estado B (panel a) y el estado C (panel b), mostrados en contexto con el resto del complejo (izquierda) y como dibujos animados (derecha). El movimiento del ARNr asociado con la estabilización de la plataforma se muestra con flechas. ( c, d ) Modelos y densidad crio-EM que muestran la transición del ARNr de plataforma entre el estado B (panel c) y el estado C (panel d). Las flechas en todos los paneles resaltan los cambios conformacionales que ocurren durante la transición del estado B al estado C.

(a – c) Modelos de METTL17, Rsm22 y SAF1 (Rsm22 en T. brucei, PDB:6SGB) 15 respectivamente, con elementos de ARNr asociados (arriba). A continuación, densidades crio-EM y modelos para ligandos y sus sitios de unión asociados con cada factor de ensamblaje (para T. brucei, el mapa es EMD-10180, y la densidad vacía se modeló originalmente como Zn2+)15. ( d, e ) Ordenamiento de elementos proteicos mitoribosomales de levadura (que se muestran como dibujos animados) en el dominio de la cabeza inducido por la disociación de Rsm22 y la compactación de la cabeza. Los péptidos que se ordenan entre el estado 3 y la estructura madura se colorean en un tono más oscuro. Los componentes adicionales de proteínas y ARN se muestran como superficies transparentes. Estructura madura derivada de PDB:5MRC19. Se omitieron los modelos de ARN para mayor claridad. ( f, g ) Ordenamiento de elementos proteicos mitoribosomales humanos (que se muestran como dibujos animados) en el dominio de la cabeza inducido por la disociación de METTL17 y la compactación de la cabeza. Los péptidos que se ordenan entre el estado E y la estructura madura se colorean en un tono más oscuro. Los componentes adicionales de proteínas y ARN se muestran como superficies transparentes. Estructura madura derivada de PDB:6RW469. El ARN previamente ordenado se omite para mayor claridad en estructuras maduras.

Higos suplementarios. 1–27.

Los archivos de datos complementarios 1 a 4 contienen péptidos identificados en muestras de METTL1 humano LC-MS/MS, levadura Ccm1 LC-MS/MS, levadura Rsm22 LC-MS/MS y levadura Mtg3 LC-MS/MS. Los datos complementarios 5 contienen un análisis comparativo de espectrometría de masas de partículas de mtSSU de levadura KO WT y PET127 aisladas mediante uS17m. Los experimentos de IP-MS/MS se realizaron por triplicado para cada condición (n = 3 experimentos biológicamente independientes). Se utilizó una prueba t de Student bilateral para determinar los valores de p para los cambios en la abundancia de proteínas entre los experimentos de purificación WT y PET127 KO mtSSU.

Sesión PyMOL StateA.pse que incluye la estructura del Estado A humano con proteínas y ARNr anotados, coloreada como en la Fig. 1. Sesión PyMOL StateB.pse que incluye la estructura del Estado B humano con proteínas y ARNr anotados, coloreada como en la Fig. 1. Sesión PyMOL StateC.pse que incluye la estructura del Estado C humano con proteínas y ARNr anotados, coloreada como en la Fig. 1. Sesión PyMOL StateD.pse que incluye la estructura del Estado D humano con proteínas y ARNr anotados, coloreada como en la Fig. 1. Sesión PyMOL StateE.pse que incluye la estructura del Estado E humano con proteínas y ARNr anotados, coloreada como en la Fig. 1. Sesión PyMOL StateCstar.pse que incluye la estructura del Estado C* humano con proteínas y ARNr anotados, coloreada como en la Fig. 1 .Sesión PyMOL State1.pse que incluye la estructura de la levadura Estado 1 con proteínas y ARNr anotados, coloreada como en la Fig. 1. Sesión PyMOL State2.pse que incluye la estructura de la levadura Estado 2 con proteínas y ARNr anotados, coloreada como en la Fig. 1 .State3.pse Sesión PyMOL que incluye la estructura de la levadura Estado 3 con proteínas anotadas y ARNr, coloreada como en la Fig. 1. comparativa_human_states.pse Sesión PyMOL que incluye las estructuras alineadas de los Estados AE humanos, cada una con proteínas anotadas y ARNr, coloreadas como en Fig. 1. Sesión PyMOL comparativa_yeast_states.pse que incluye las estructuras alineadas de los estados de levadura 1-3, cada una con proteínas y ARNr anotados, coloreados como en la Fig. 1.

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Harper, Nueva Jersey, Burnside, C. y Klinge, S. Principios del ensamblaje de subunidades pequeñas mitoribosomales en eucariotas. Naturaleza 614, 175–181 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-022-05621-0

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Recibido: 13 de julio de 2022

Aceptado: 02 de diciembre de 2022

Publicado: 08 de diciembre de 2022

Fecha de emisión: 02 de febrero de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-05621-0

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