Las proteínas de la cola del fago SU10 se reorganizan en la boquilla para la entrega del genoma

Nature Communications volumen 13, número de artículo: 5622 (2022) Citar este artículo

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El fago SU10 de Escherichia coli pertenece al género Kuravirus de la clase Caudoviricetes de fagos con colas cortas no contráctiles. A diferencia de otros fagos de cola corta, las colas de los Kuravirus se alargan al unirse a las células. Aquí mostramos que el virión de SU10 tiene una cabeza alargada, que contiene genoma y proteínas de eyección, y una cola, que está formada por proteínas de portal, adaptador, boquilla y aguja de cola y decorada con fibras largas y cortas. La unión de las fibras largas de la cola a los receptores de la membrana bacteriana externa induce el enderezamiento de las proteínas de la boquilla y la rotación de las fibras cortas de la cola. Después de la reorganización, las proteínas de la boquilla y las fibras cortas de la cola se alternan para formar una boquilla que extiende la cola 28 nm. Posteriormente, la aguja de la cola se desprende de las proteínas de la boquilla y se liberan cinco tipos de proteínas de eyección de la cabeza SU10. La boquilla con la supuesta extensión formada por las proteínas de eyección permite la entrega del genoma SU10 al citoplasma bacteriano. Es probable que todos los Kuravirus empleen este mecanismo de entrega del genoma, que implica la formación de la boquilla de la cola.

Los fagos del género Kuravirus pertenecen a la clase Caudoviricetes de fagos con colas cortas no contráctiles1. Los kuravirus, incluido el fago SU10 de Escherichia coli, se distinguen entre los fagos de cola corta por genomas grandes con 75 a 80 000 pares de bases que codifican más de 50 proteínas 2,3,4. Los kuravirus son líticos y algunos de ellos tienen ciclos de replicación cortos y producen una progenie abundante, lo que los convierte en candidatos para su uso en terapia con fagos contra cepas patógenas de E. coli5,6,7. En un estudio de caso se utilizó un cóctel de fagos que contenía el fago ES17, del género Kuravirus, para tratar la infección por E. coli de la próstata y el tracto urinario8.

Los genomas de los kuravirus están alojados en cabezas alargadas, caracterizadas por una simetría quíntuple y un alargamiento en la dirección del eje de la cola2,3. Los genomas de los fagos con cola se empaquetan en procabezas preformadas mediante motores moleculares a través de un canal formado por el dodecámero de las proteínas portales, que reemplaza un pentámero de las proteínas de la cápside en uno de los cinco vértices de la cápside. Las colas de los fagos están unidas a los complejos portales9. Los componentes comunes de la cola de los fagos con colas cortas que infectan bacterias Gram-negativas son las proteínas adaptadoras, las proteínas principales de la cola, las proteínas de la aguja de la cola y las fibras de la cola10. Las fibras de la cola permiten la unión inicial de los fagos a las bacterias11,12,13, mientras que las agujas de la cola son responsables de la penetración de la membrana externa de la célula huésped14,15. Las cabezas de la mayoría de los fagos de cola corta contienen proteínas de expulsión, que permiten la entrega de genomas de fagos a las células huésped. Las proteínas de eyección forman un complejo de translocación que alarga la cola para abarcar la pared celular bacteriana 16,17,18,19. La presión dentro de la cabeza del fago permite la expulsión del 30 al 50% del genoma hacia una célula bacteriana20,21,22. Sin embargo, después de igualar las presiones dentro de la cabeza del fago y el citoplasma bacteriano, el resto del ADN debe ser entregado a la bacteria mediante otro mecanismo21,23,24. Se ha demostrado, mediante microscopía electrónica de tinción negativa, que el fago SU10 tiene una cola más larga que la mayoría de los fagos anteriormente clasificados en la familia Podoviridae, y que la cola sufre un cambio conformacional al unirse a las bacterias2.

Aquí presentamos las estructuras de microscopía crioelectrónica (crio-EM) del virión y el intermediario de liberación del genoma del bacteriófago SU10 y la caracterización de la tomografía crioelectrónica (crio-ET) de su unión a las células de E. coli. Después de unirse al huésped, la cola SU10, las proteínas de la boquilla y las fibras cortas se reorganizan para formar una boquilla que extiende la cola. Los Kuravirus comparten más del 70% de similitud de secuencia en las proteínas de su cola. Por lo tanto, es probable que este mecanismo de entrega del genoma, que implica la formación de la boquilla de la cola, sea empleado por la mayoría, si no por todos, los Kuravirus.

El virión del bacteriófago SU10 tiene una cabeza alargada con una longitud de 1430 Å y un diámetro de 460 Å, que está formada por la proteína principal de la cápside (gp9) (Fig. 1a, Tabla complementaria 1, 2)2. La cola tiene 220 Å de largo y está decorada con seis fibras de cola largas y seis cortas (Fig. 1a – c, 2a, c, Tabla complementaria 1, 2). La cola está unida a uno de los vértices de la cápside prolata, donde el dodecámero de las proteínas portales (gp6) reemplaza al pentámero de las proteínas de la cápside (Figs. 1a a c). La parte del complejo portal que sobresale de la cápside permite la unión del dodecámero de las proteínas adaptadoras (gp11). El complejo adaptador proporciona seis sitios de unión para las fibras de la cola larga, cada uno de los cuales está formado por un trímero de proteínas proximales de la fibra de la cola larga (gp12) y un trímero de proteínas distales de la fibra de la cola larga (gp13) (Figs. 1c, 2a, c). . Un hexámero de proteínas de boquilla (gp17) está unido al complejo adaptador y permite la unión de seis fibras de cola corta, trímeros de proteína de fibra de cola corta (gp16) (Fig. 2a, c). La aguja de la cola, que está formada por tres cadenas polipeptídicas (gp18), sobresale del canal central formado por las proteínas de la boquilla (Figs. 1a-c y 2a, c).

a Representación de superficie del mapa crio-EM compuesto del virión del fago SU10 coloreado según el tipo de proteína. La proteína principal de la cápside (gp9) se muestra en turquesa, la proteína portal (gp6) en magenta, la proteína adaptadora (gp11) en amarillo, las fibras largas de la cola (gp12) en violeta, la proteína de la boquilla (gp17) en rojo, las fibras cortas de la cola (gp16). ) en verde y la aguja de la cola (gp18) en azul claro. La longitud del virión es de 1590 Å. Para obtener detalles sobre la construcción del mapa compuesto, consulte la sección Materiales y métodos. b Igual que A, pero la mitad frontal del mapa compuesto de la cabeza SU10 se eliminó para mostrar la estructura del genoma en gris. El recuadro muestra un promedio de clase 2D del virión SU10. La barra de escala indica 45 nm. c Mapa crio-EM compuesto de complejos de portal y cola del virión SU10. La longitud del complejo es de 540 Å. D Reconstrucción crio-EM de complejos de portal y cola a partir de un intermediario de liberación del genoma SU10. e Mapa crio-EM compuesto del intermedio de liberación del genoma de SU10. Se eliminó la mitad frontal de la cabeza para mostrar la estructura del genoma que queda en la cápside. El recuadro muestra un promedio de clase 2D del intermedio de liberación del genoma SU10. f Representación esquemática del segmento del genoma SU10 que codifica proteínas estructurales codificadas por colores igual que las proteínas en los paneles a al e. Las proteínas que se muestran en blanco no son estructurales o no fueron identificadas en las reconstrucciones.

Representaciones en dibujos animados de proteínas que forman la cola del virión SU10 a, cy el intermediario de liberación del genoma b, d. La proteína portal (gp6) se muestra en magenta, la proteína adaptadora (gp11) en amarillo, la proteína de fibra de cola larga (gp12) en violeta, la proteína de boquilla (gp17) en rojo, la proteína de fibra de cola corta (gp16) en verde y la aguja de cola. proteína (gp18) en azul claro. vistas a, b perpendiculares al eje de la cola y vistas c, d a lo largo del eje de la cola hacia la cabeza del fago. En el virión SU10, las fibras cortas de la cola están inclinadas hacia la cápside y la aguja de la cola sobresale del complejo de la cola. El intermediario de liberación del genoma de SU10 b, d carece de aguja en la cola y contiene una boquilla de 277 Å de largo formada por fibras cortas de la cola y proteínas de la boquilla. La aguja de la cola y el dominio central y de unión al receptor de la fibra de la cola corta se modelaron utilizando el multímero AlphaFold2 y se ajustaron al mapa crio-EM. Las estructuras restantes se construyeron en reconstrucciones crio-EM. Para obtener detalles sobre la predicción y construcción de estructuras, consulte la sección Materiales y métodos.

La cápside prolata de SU10 está organizada con simetría quíntuple y está construida a partir de 715 copias de la proteína de la cápside principal organizada con los parámetros de triangulación Tend = 4, Tmid = 20 (Fig. 3a, Fig. complementaria 1, 2). La proteína principal de la cápside forma capsómeros de dos tipos: pentámeros y hexámeros. La parte tubular central de la cápside está construida a partir de 90 hexámeros dispuestos en nueve capas de una hélice de diez entradas (Fig. 3a). La cápside está cerrada en ambos extremos con tapas formadas por las principales proteínas de la cápside organizadas con simetría cuasiicosaédrica local T = 4. El cierre de las tapas lo permiten los pentámeros, que están doblados en contraste con los hexámeros más planos (Fig. 3a, Fig. 1 complementaria). Sin embargo, la formación de la cabeza SU10 alargada también requiere variación en la forma de los hexámeros y en los ángulos en los que interactúan. Los hexámeros en las tapas están más curvados (H4, H5; 149-150°), mientras que los que forman la parte tubular de la cápside son relativamente planos (H1, H2L, H2R, H3; 154-164°) (Figura complementaria. 2). Todas las interfaces hexámero-hexámero y hexámero-pentámero en las tapas están arqueadas (145°) (Figura complementaria 2A), sin embargo, los hexámeros que forman la parte tubular de la cápside están conectados por dos tipos de interfaces, arqueadas (145°) y más plano (160 °) (Figura complementaria 2). Las interfaces arqueadas permiten la formación de anillos de hexámeros, mientras que las más planas median las interacciones entre los anillos (Figura complementaria 2).

a Representación en caricatura de proteínas que forman el virión del fago SU10. La cápside prolata tiene simetría quíntuple y las proteínas de la cápside están organizadas con los parámetros de Tend = 4, Tmid = 20. Los pentámeros de las proteínas de la cápside se muestran en naranja, los hexámeros en cian oscuro o verde mar claro. Los pentámeros son de dos tipos, según su posición en la cápside. El pentámero P1 está colocado en el eje quíntuple de la partícula, mientras que los pentámeros P2 restantes están colocados en ejes cuasi quíntuple en los límites entre la parte tubular de la cápside y las tapas. Existen seis variantes de hexámeros: H1 que forma la parte central de la cabeza prolata; H2L y H2R pertenecen a la parte central de la cápside pero interactúan con las tapas terminales; H3 están entre pentámeros P2; H4 están entre pentámeros P1 y P2; y H5 están entre los pentámeros P2 y el complejo portal. b Comparación de las estructuras de las principales proteínas de la cápside que forman el hexámero H1 (coloreado según los dominios) y el pentámero P1 (blanco). La principal proteína de la cápside de SU10 tiene un pliegue HK9725,66. Las principales diferencias en las estructuras de las subunidades P1 y H1 se encuentran en el brazo N-terminal, el bucle extendido y el bucle anular. La organización del dominio de la proteína principal de la cápside se muestra como un gráfico 1D. c Representación en dibujos animados de las principales proteínas de la cápside que forman el pentámero P2 y el hexámero H2R. Dos proteínas principales de la cápside que median en la mayoría de los contactos entre el pentámero y el hexámero se muestran con dominios resaltados en color. Las subunidades restantes se muestran alternando entre blanco y gris oscuro. Los bucles G de todas las subunidades están resaltados en magenta.

La proteína principal de la cápside de SU10 tiene un pliegue HK97, que es común entre los bacteriófagos con cola y los herpesvirus (Fig. 3b)25. Según la convención, la proteína de la cápside se puede dividir en el brazo N-terminal, el dominio periférico, el bucle extendido, el dominio axial y el bucle rico en glicina (Fig. 3b). La principal diferencia entre las proteínas de la cápside que forman hexámeros y pentámeros está en la estructura del bucle anular ubicado en la punta del dominio axial (Fig. 3b). En los hexámeros, el bucle anular sobresale del dominio axial (Fig. 3b, c). Los seis bucles anulares de las subunidades que forman un hexámero forman un anillo alrededor de su eje cuasi séxtuple (Fig. 3c). Por el contrario, en las subunidades que forman pentámeros, el bucle anular está doblado 90 ° hacia el centro de la cápside (Fig. 3c). Las hebras beta de los bucles de las principales proteínas de la cápside de un pentámero forman un barril beta con un poro central con un diámetro de 8 Å que penetra a través de la cápside. (Fig. 3c, Fig. Suplementaria 3G). El poro puede servir para el paso de iones y moléculas de agua desde y hacia la cápside durante el empaquetado y la expulsión del genoma.

El genoma de SU10 codifica una proteína (gp10) con un pliegue predicho similar a una inmunoglobulina similar al de la proteína de la cápside menor del fago Epsilon15 y al dominio N-terminal de la proteína de la fibra de la cabeza del bacteriófago φ2926,27. Sin embargo, la reconstrucción crio-EM de la cabeza SU10 no contiene la densidad correspondiente a las proteínas menores de la cápside. Es posible que la gp10 de SU10 tenga una función diferente o se una a la cápside con baja afinidad y se haya perdido durante la purificación del fago (Figura complementaria 4C).

La densidad crio-EM del genoma en el virión SU10 se resolvió en reconstrucciones quíntuples simétricas y asimétricas de su cabeza (Fig. 1b, Fig. complementaria 3). A pesar de las diferencias en las simetrías impuestas durante los procesos de reconstrucción, las disposiciones de las densidades del genoma son similares (Figuras complementarias 3A a D). Se pueden distinguir nueve capas de densidad dentro de la parte tubular de la cabeza, mientras que solo cuatro capas se resuelven debajo de las tapas de la cápside (Figura complementaria 3). En las tres capas más externas, la densidad se separa en hebras, que pueden interpretarse como segmentos de ADN bicatenario (Figuras complementarias 3A a D, F). La estructura resuelta del genoma en la reconstrucción crio-EM indica que el empaquetado del genoma da como resultado un orden similar del ADN en la mayoría de los viriones SU10. Sin embargo, los enlaces entre los segmentos de ADN en la parte central de la cabeza SU10, que deben existir porque el genoma está formado por un único ADN2 bicatenario de 77.325 pb de largo, no se resuelven. En las reconstrucciones quíntuples simétricas y asimétricas de la cabeza SU10, las hebras de ADN en las dos capas más externas están organizadas como hélices de diez entradas (Figuras complementarias 3B, D). Las hebras de ADN de la capa más externa del genoma se curvan para evitar los barriles beta que sobresalen de los pentámeros de las proteínas de la cápside (Figura complementaria 3G). La intrigante organización del ADN puede usarse como restricciones adicionales en futuros estudios del proceso de empaquetado del genoma en fagos mediante simulaciones por computadora.

Las proteínas gp20-24 están presentes en el virión SU10, pero ausentes en el intermedio de liberación del genoma, lo que indica que son proteínas de eyección (Figura 4C complementaria, Tabla 1 complementaria). Sin embargo, la reconstrucción del virión SU10 no contiene una densidad resuelta que pueda atribuirse a las supuestas proteínas de eyección (Fig. 1b), como es el caso de los fagos de cola T7, Epsilon15 y N417,18,28. El genoma de SU10 está empaquetado en la cápside con una densidad de 0,48 Da/Å3, que es comparable a los 0,49-0,52 Da/Å3 determinados previamente para los bacteriófagos P22, lambda, T4, ϕ29 y T729. Por tanto, la cápside de SU10 podría contener tanto ADN genómico como proteínas de eyección.

El complejo portal de SU10 está incrustado en la cápside en uno de sus cinco vértices, donde reemplaza un pentámero de proteínas de la cápside (Figs. 1a, b, 4a). La proteína portal de SU10 se puede dividir en los dominios de ala, tallo, clip, corona y barril (Fig. 4b)29. El dominio del ala es el más grande y está formado por ocho hélices y un sándwich β que contiene dos láminas β de cinco y tres hebras β antiparalelas (Fig. 4b). Las cadenas laterales cargadas positivamente de Lys3 y Lys5 del dominio del ala interactúan con el ADN que envuelve el complejo del portal (Fig. 4a). Las dos lisinas se repiten doce veces en el complejo portal y, por lo tanto, forman una interfaz de alta avidez que probablemente se unirá al ADN poco después de que se inicie el empaquetamiento del genoma. Anclar el extremo del ADN al portal influiría en el empaquetado del genoma en la cabeza y en su estructura final. Además, el dominio del ala media las interacciones del complejo portal con la cápside (Fig. 4a, c). Debido a la discrepancia entre la simetría quíntuple de la cápside y la simetría doce del portal, caracterizamos sus interacciones utilizando una reconstrucción asimétrica de la región del cuello del virión SU10, que alcanzó una resolución de 4,6 Å (Tabla complementaria 2). Los residuos 8 a 44 del dominio del ala forman una hélice α curva que recubre la cara interna de la cápside (Fig. 4a, b). Las interacciones adicionales entre el portal y la cápside están mediadas por el bucle del vástago del dominio del ala (Fig. 4a, b). El bucle del túnel desde el dominio del ala estrecha el canal del portal de SU10 a 33 Å (Fig. 4, Fig. Suplementaria 5). En los fagos T7 y P23-45, se demostró que los bucles del túnel abren el canal portal y, por tanto, regulan la liberación del genoma15,30. Sin embargo, los bucles de túnel en el virión SU10 y el intermediario de liberación del genoma tienen la misma estructura, por lo tanto, es probable que un mecanismo diferente asegure la retención del genoma de SU10 (Figura complementaria 5). El dominio del tallo conecta los dominios del ala y del clip y se extiende a lo largo de la cápside (Fig. 4b). El dominio clip del complejo portal se extiende desde la cápside y permite la unión de las proteínas adaptadoras (Fig. 4a).

Una representación caricaturesca del complejo portal incrustado en la cápside. Una proteína portal se muestra en magenta y las subunidades restantes en blanco y gris alternados. La densidad crio-EM de la cápside se muestra en turquesa y la del ADN en gris. La densidad de un supuesto extremo del genoma de ADNbc o proteínas de eyección dentro del cilindro del complejo portal se muestra en naranja. Los mapas de la cápside y el ADN se muestran en 2σ y 4σ, respectivamente. b Representación en caricatura de una subunidad de proteína portal coloreada según la composición del dominio. La organización del dominio de la proteína portal se muestra como un gráfico 1D. c Interacciones del complejo portal con la cápside, vistas a lo largo del eje de la cola desde fuera de la partícula. Las proteínas del portal se muestran en rosa y violeta alternados, las proteínas de la cápside se muestran en turquesa oscuro y claro. Las direcciones de las hélices de la columna de los dominios periféricos de las principales proteínas de la cápside y las hélices N-terminales de los dominios de las alas de las proteínas del portal se resaltan con flechas para enfatizar el desajuste entre la simetría quíntuple de la cápside y la simetría doce del portal.

El dodecámero de las proteínas adaptadoras SU10 forma la interfaz entre el dodecámero de las proteínas portales y el hexámero de las proteínas de la boquilla (Figs. 1c, 2a y 5). La proteína adaptadora de SU10 tiene la misma organización de dominio que las de los fagos T7 y KP32: un dominio de haz de hélice, un dominio de muelle de fibra de cola larga y un bucle envolvente (Fig. 5c) 15. Un bucle envolvente de proteína adaptadora se encaja entre los dominios de clip de un par de proteínas portal vecinas y se une a los bucles de tallo de dos proteínas portal adicionales ubicadas en el sentido de las agujas del reloj cuando se mira el complejo portal desde fuera de la cápside (Fig. 5f). Los dominios de acoplamiento de la fibra de cola larga de dos proteínas adaptadoras vecinas difieren en estructura porque interactúan con diferentes partes de una fibra de cola larga (Fig. 5a, b, d). El dominio de acoplamiento de fibras de cola larga SU10 es similar a los de los fagos T7 y KP32 (Figura complementaria 6) 15,31, que tienen fibras de cola largas 13,32. Por el contrario, las proteínas adaptadoras de los fagos P22 y Sf6, que no tienen fibras de cola largas, carecen de los dominios de acoplamiento de las fibras de cola larga (Figura complementaria 6) 12,27.

a, b Representación en caricatura del complejo adaptador decorado con seis fibras largas de la cola vistas a lo largo y perpendicular al eje de la cola. Dos proteínas adaptadoras seleccionadas del dodecámero están resaltadas en naranja y amarillo. Las subunidades restantes se muestran alternando blanco y gris. Cada una de las seis fibras largas de la cola está formada por un trímero de proteínas gp12 (violeta). c Superposición de estructuras de dos proteínas adaptadoras vecinas que difieren en la conformación de sus bucles de fibra de cola larga. Una de las proteínas adaptadoras está coloreada según la composición del dominio. La subunidad superpuesta se muestra en blanco. La organización del dominio de la proteína adaptadora se muestra como un gráfico 1D. d Interacciones de proteínas adaptadoras con fibra de cola larga. Los bucles de fibra (verde) de dos proteínas adaptadoras vecinas interactúan con una fibra de cola larga. Las tres subunidades que forman la fibra de la cola larga se diferencian por tonalidades violetas. El extremo N de cada proteína de fibra de cola larga de una fibra de cola larga forma interacciones únicas con el complejo adaptador. e Interacciones del complejo adaptador con la cápside vistas a lo largo del eje de la cola desde fuera de la partícula. Las proteínas adaptadoras se muestran alternando entre amarillo y naranja, las proteínas de la cápside se muestran en tonos turquesa. Las direcciones de las hélices de la columna de los dominios periféricos de las principales proteínas de la cápside y los bucles de fibra de las proteínas adaptadoras se indican con flechas para enfatizar el desajuste de simetría entre la cápside y el complejo adaptador. f Interfaz entre las proteínas portales y los bucles C-terminales de proteínas adaptadoras. El bucle envolvente (naranja) pasa entre los dominios de clip del portal de la subunidad portal A (gris) y B (blanco), luego cruza el tallo de la subunidad portal C (magenta oscuro) y llega entre el bucle del ala (cian) de la subunidad. C y tallo de la subunidad D (rosa). Las proteínas adaptadoras vecinas se diferencian por la estructura de sus bucles envolventes. El bucle envolvente (amarillo) de la proteína adaptadora con la otra conformación pasa entre los dominios de clip portal de las subunidades portales B (blanco) y C (magenta oscuro), luego cruza el tallo de la subunidad portal D (rosa) y llega entre las bucle del ala (azul claro) de la subunidad D (gris) y tallo de la subunidad E (rosa).

Seis fibras de cola largas están unidas a los lados del complejo adaptador (Figs. 1a a c, 2a y 5a, b). La fibra de la cola larga de SU10 está formada por trímeros de proteínas proximales (gp12) y distales (gp13) de la fibra de la cola larga. Una fibra de cola larga se ramifica desde el dominio del haz de hélice de cada segunda subunidad del complejo adaptador (Figs. 2a, cy 5a, b). Los extremos N de dos proteínas proximales de fibra de cola larga de una fibra se extienden para cubrir la superficie del dominio del haz de hélice de la proteína adaptadora vecina ubicada en sentido antihorario cuando se mira el complejo adaptador desde fuera de la cápside (Fig. 5b, d). El extremo N de la tercera proteína proximal de la fibra de cola larga se une al dominio de acoplamiento de la fibra de cola larga de la proteína adaptadora desde donde se ramifica la fibra (Fig. 5d). Las fibras de la cola larga forman contactos adicionales con los bucles de acoplamiento de fibras que sobresalen radialmente de los dominios de acoplamiento de fibras de las proteínas adaptadoras (Fig. 5a, c, d). La parte enrollada de cada fibra de cola larga se sujeta mediante bucles de fibra de dos proteínas adaptadoras vecinas (Fig. 5a, d). La reconstrucción crio-EM de la cola permitió la construcción de 90 residuos del extremo N de la proteína proximal de la fibra de cola larga de 786 residuos (Figs. 2a, cy 5a, b). El resto de la fibra de la cola larga no se resolvió, probablemente debido a su flexibilidad. Las micrografías electrónicas de fagos purificados muestran que la fibra de la cola larga tiene 700 Å de largo y contiene una articulación del codo, que divide la fibra en segmentos de 300 y 400 Å de largo (Figuras complementarias 4a, b).

El hexámero de proteínas de la boquilla, unido al adaptador, está decorado con seis fibras de cola cortas y su canal central está tapado con una aguja de cola (Figs. 1a-c, 2a, cy 6). De acuerdo con la convención establecida para el fago T715, la proteína de boquilla de SU10 se puede dividir en los dominios de plataforma, hélice beta y boquilla (Fig. 6a-c). Sin embargo, las proteínas de la boquilla de SU10 y T7 no muestran ninguna similitud de secuencia detectable.

Representación en caricatura del hexámero de proteínas de boquilla con fibras de cola cortas unidas del virión SU10 visto desde fuera de la partícula a lo largo (a) y perpendicular (b) al eje de la cola. Las proteínas de la boquilla se muestran en blanco y gris alternados, y las fibras cortas de la cola en verde. Una de las proteínas de la boquilla está resaltada en color, con el dominio de la plataforma mostrado en naranja, el dominio de la hélice beta en azul, el muelle de fibra de cola corta en magenta y cuatro dominios de la boquilla en rojo. La punta de flecha negra en el panel (b) muestra la interacción del dominio de boquilla 4 y la fibra de cola corta. c Comparación de estructuras de proteínas de boquilla y fibras de cola corta en el virión SU10 y el intermediario de liberación del genoma. La proteína de la boquilla del virión está coloreada como en los paneles a y b, y las tres subunidades gp16 que forman una fibra de cola corta se distinguen por tonos de verde. Las estructuras superpuestas de la proteína de la boquilla y la fibra de la cola corta del intermedio de liberación del genoma se muestran en blanco y verde claro, respectivamente. La organización del dominio de la proteína de la boquilla se muestra como un gráfico 1D. d Comparación de estructuras de dominios de hélice beta de proteínas de boquilla del virión SU10 y del intermediario de liberación del genoma, que se muestran en colores del arco iris y en blanco, respectivamente. El dominio de la hélice beta de siete palas tiene los colores del arco iris desde el extremo N en azul hasta el extremo C en rojo. El bucle de muelle de fibra de cola corta es una extensión de la pala 1 (β1), mientras que los dominios de la boquilla se insertan entre la pala 2 (β2) y la pala 3 (β3). e Interacciones del loop de fibra corta (magenta) con tres proteínas de fibra de cola corta (tonos de verde). Las cadenas laterales de Trp839, Trp847 y Trp857 del bucle de fibra corta forman una estrella con simetría casi triple, que permite la unión de la fibra de la cola corta, que es un trímero. Los residuos Tyr23, Ile24 y Tyr25 de cada proteína de fibra de cola corta sujetan un segmento del bucle de fibra antes de cada uno de los triptófanos.

El dominio de la plataforma tiene un pliegue beta-sándwich con las dos láminas beta formadas por cinco y tres hebras beta, respectivamente (Fig. 6c). El dominio de plataforma de cada proteína de boquilla interactúa con los dominios del haz de hélice de dos proteínas adaptadoras adyacentes. Las distintas interacciones de las proteínas de la boquilla sólo inducen diferencias mínimas en la estructura de las proteínas adaptadoras vecinas.

El dominio de la hélice beta de siete palas tiene un diámetro de 50 Å y forma el núcleo de la proteína de la boquilla (Fig. 6d). Las palas 4, 5 y 6 del dominio de la hélice beta se alinean en el canal de la cola, mientras que las palas 1, 2 y 3 están distantes del eje de la cola. El dominio de la hélice beta está interrumpido por dos puntos de entrada y salida de la cadena principal del polipéptido, los llamados orificios. La primera abertura en la hoja 1 incluye la entrada de la cadena principal desde la parte N-terminal del dominio de la plataforma y la salida de la cadena principal a la parte C-terminal del dominio de la plataforma (Fig. 6d). La estructura de la pala 1 de la hélice beta se estabiliza mediante la interacción antiparalela de la hebra beta más externa, que está formada por residuos C-terminales del dominio, con las hebras restantes formadas por residuos del extremo N-terminal del dominio. , el llamado cierre de velcro (Fig. 6d)33. La segunda abertura es causada por la inserción de dominios de boquilla entre las palas de la hélice beta 2 y 3 (Fig. 6d). Los bucles que sobresalen de los bordes de las hojas 4 y 5 permiten sujetar la aguja de cola. Los bucles tienen diferentes conformaciones en el intermedio de liberación del genoma, lo que da como resultado el ensanchamiento del diámetro del canal de la cola de 25 a 31 Å (Figura complementaria 5). El bucle de acoplamiento de fibra de cola corta está ubicado en el borde de la pala 1 del dominio de la hélice beta y permite la unión de una fibra de cola corta (Fig. 6c-e).

En el virión SU10, los dominios de boquilla tipo Ig están organizados en forma de L (Figs. 2a, 6a-c). Los dos primeros dominios de la boquilla forman una punta roma de la cola, luego hay un giro de 82 ° y los dos dominios restantes apuntan hacia la cápside (Fig. 6c). Los contactos entre las proteínas de la boquilla están mediados por los dominios de plataforma y hélice beta. Además, los dominios de la boquilla se envuelven alrededor de la cola, y el dominio de la boquilla 1 interactúa con los dominios de la boquilla 2 y 3 de la proteína de la boquilla ubicada en el sentido de las agujas del reloj cuando se mira la cola a lo largo de su eje hacia la cápside (Fig. 6a, b). El dominio 4 de la boquilla interactúa con el bucle de acoplamiento de fibra de cola corta de la proteína de la boquilla ubicada en el sentido contrario a las agujas del reloj (Fig. 6a, b). Las múltiples interacciones de los dominios de la boquilla estabilizan la estructura nativa de la cola SU10.

La fibra de la cola corta de SU10 tiene una longitud de 210 Å, es recta y se puede dividir en dominios proximal, central y de unión al receptor (Figs. 2, 6a a c, Fig. complementaria 7). El dominio proximal se reconstruyó con una resolución de 3,8 Å, lo que permitió la construcción de los primeros 98 residuos de gp16 (Fig. 6a-c, Fig. complementaria 7). Las hélices alfa que forman el dominio proximal están interrumpidas por bucles cortos que median el intercambio de posiciones de las hélices de las subunidades individuales dentro del dominio (Figura complementaria 7). Los dominios central y de unión al receptor modelados utilizando el programa multímero AlphaFold2 podrían adaptarse a las reconstrucciones crio-EM de resolución de 7 y 15 Å, respectivamente, con un coeficiente de correlación en el espacio real de 0,81 (Figura complementaria 7A) 34. El dominio central es similar a la punta de la fibra de la cola corta del fago T4 (PDB: 1PDI) (Figura complementaria 7)35,36, mientras que el dominio de unión al receptor se parece a la punta de la fibra de la cola larga del fago T4 (PDB : 2XGF), que reconoce los lipopolisacáridos o la proteína C porina de la membrana externa (Figura complementaria 7)36. Además, tanto el dominio central como el de unión al receptor son similares a las partes correspondientes de la proteína de unión al receptor del bacteriófago templado JUB59 (PDB: 6OV6) (Figura complementaria 7)37. La proteína de fibra de cola corta SU10 contiene dos pares de histidinas (His194 e His196, His230 y His232), que pueden unirse a iones Fe2+ y así estabilizar la fibra, como ocurre en T4 y JUB5936,37,38,39.

La fibra de la cola corta está unida a un bucle de fibra de una proteína de boquilla (Fig. 6c, e). El bucle de fibra contiene triptófanos 839, 847 y 857, cuyas cadenas laterales están dispuestas en una pseudo simetría triple (Fig. 6e). Cada cadena lateral de triptófano forma interacciones hidrofóbicas con Ile24 de una de las tres proteínas de fibra de cola corta (Fig. 6e). Además, las cadenas laterales de Tyr23, Ile24 y Tyr25 de cada fibra de cola corta sujetan un segmento del polipéptido antes de los triptófanos del bucle de acoplamiento de la fibra (Fig. 6e). Los residuos 3 a 6 de la fibra de la cola corta interactúan con los residuos 303 a 308 del dominio 4 de la boquilla de la proteína de la boquilla ubicada en el sentido de las agujas del reloj cuando se mira a lo largo del eje de la cola hacia la cápside (Fig. 6b). La posición de la fibra de la cola corta se estabiliza adicionalmente mediante la interacción del dominio central de la fibra de la cola corta con los residuos 71 a 78 de la fibra de la cola larga (Figs. 1c, 2a, c). Es probable que la interrupción de estas interacciones permita la coordinación de los cambios conformacionales de las fibras largas y cortas de la cola, así como los de las proteínas de la boquilla, tras la unión de SU10 a la célula huésped.

La estructura de la aguja de la cola SU10 con simetría triple impuesta se reconstruyó con una resolución de 15 Å (Figs. 1a a c, 2a, c, Fig. complementaria 8). La estructura de la aguja de la cola, predicha por el multímero Alphafold2, se puede dividir en dominios de bobina enrollada y C-terminal, y podría adaptarse a la densidad crio-EM con un coeficiente de correlación en el espacio real de 0,80 (Figura complementaria 8A, B). El dominio en espiral de la aguja de la cola SU10 es homólogo a la aguja de la cola del fago P2214, que se demostró que se dobla hasta 18°40. Por lo tanto, esperamos que la aguja de la cola de SU10 sea igualmente flexible, lo que puede ser la razón por la que no pudimos resolverla en alta resolución. El dominio C-terminal tiene una estructura de prisma beta similar a la de las puntas centrales de la cola de los fagos Myoviridae (Fig. 2a, c, Fig. complementaria 8A, B) 38,41,42. La unión de la aguja de la cola SU10 al canal de la cola se permite mediante dos bucles en la cuchilla 4 y un bucle en la cuchilla 5 del dominio de la hélice beta de las proteínas de la boquilla (Figuras complementarias 8C, D). La aguja de cola de 260 Å de largo sobresale 200 Å del complejo de boquillas (Figs. 1c, 2a, c).

La cápside del intermediario de liberación del genoma de SU10 es idéntica a la del virión (Fig. 1, Tabla complementaria 3). La inducción de la liberación del genoma SU10 in vitro mediante choque osmótico da como resultado la expulsión incompleta del ADN del fago (Figura 4 complementaria). La reconstrucción de la cabeza del intermedio de liberación del genoma SU10 contiene anillos de supuesta densidad de ADN adheridos a la cara interna de la cápside (Fig. 1e, Fig. 9 complementaria). Aunque la densidad del ADN en la reconstrucción del intermediario de liberación del genoma está organizada en anillos, lo más probable es que el ADN que queda dentro de la cabeza sea una única hebra continua. Los anillos son artefactos causados ​​por la combinación de la variabilidad estructural de los segmentos de ADN en partículas individuales y su desalineación durante el proceso de reconstrucción. Es probable que la propensión de la cápside SU10 a organizar cadenas de ADN, como se observa en el intermedio de liberación del genoma, influya en la estructura del genoma durante el empaquetado.

La reconstrucción asimétrica de la tapa de la cápside sin cola contiene una capa esférica de densidad con un diámetro exterior de 80 Å y un espesor de pared de 15 Å (Figura complementaria 9C, E). Esta esfera de densidad también es visible en los promedios de clase bidimensionales de los intermedios de liberación del genoma (Figura complementaria 9F). La esfera no está centrada en el eje de simetría quíntuple de la cápside, sino que está conectada por una densidad al barril beta formado por bucles anulares de las principales proteínas de la cápside de un pentámero (Figura complementaria 9E). La posición de la capa esférica de densidad deja un borde del pentámero accesible para unir el ADN (Figura complementaria 9C). La reconstrucción asimétrica del virión SU10 no contenía esta capa esférica de densidad; sin embargo, es posible que la fuerte señal del genoma impidiera la alineación asimétrica requerida para resolver la estructura de la esfera. No está claro qué forma la capa esférica de densidad observada. El radio de la esfera es demasiado pequeño para que esté formado por dsDNA43 doblado. Por tanto, es probable que la cáscara esférica esté formada por proteínas.

La cola del intermediario de liberación del genoma SU10 se reorganiza en la boquilla construida a partir de proteínas de boquilla y fibras cortas de la cola (Figs. 2c, d, 6c, Fig. 5 complementaria, Película complementaria 1). Para formar la boquilla, los cuatro dominios de la boquilla experimentan un cambio estructural extenso desde la forma de L en el virión SU10 hasta la disposición recta en el intermedio de liberación del genoma (Fig. 6c). En la nueva conformación, los cuatro dominios forman una línea que apunta en dirección opuesta al complejo del portal. Si bien la interacción del bucle de fibra de la cola corta con una fibra de la cola corta permanece preservada, las conexiones del bucle de fibra de la cola corta con el dominio de la hélice beta giran entre sí y se doblan 135° para apuntar en dirección opuesta a la cabeza del fago (Fig. 6c,d). La misma rotación la realiza la fibra corta de la cola. En la nueva disposición, las proteínas de la boquilla y las fibras cortas de la cola se alternan para formar una boquilla que prolonga la cola en 277 Å (Figs. 1d, 2b, d). Además, la parte distal del dominio de la hélice beta de la proteína de la boquilla se desplaza 3 Å desde el eje de la cola, lo que resulta en un ensanchamiento del canal de la cola (Fig. 6c, Fig. Suplementaria 8C, D). La formación de la boquilla es necesaria para llevar los dominios de unión al receptor de las fibras cortas de la cola a una posición en la que puedan interactuar con la membrana externa de E. coli.

Las tomografías de E. coli infectada con SU10 demuestran que múltiples fagos pueden unirse y entregar sus genomas a una célula (Fig. 7a, Fig. 10 complementaria, Película complementaria 2). Algunos de los fagos solo estaban unidos por fibras largas de la cola, mientras que las colas de los fagos restantes formaron boquillas (Fig. 7a, Fig. Suplementaria 10). Además, los fagos con boquillas se encontraban en varias etapas de liberación del genoma, desde cabezas llenas hasta cabezas vacías. Las partículas vacías permanecieron adheridas a la superficie celular (Fig. 7a, Fig. Suplementaria 10D – F). En las últimas etapas de la infección por SU10, la muestra contenía vesículas de la membrana externa con partículas de fagos unidas (Fig. 7a, Fig. Suplementaria 10J-L). Las vesículas de membrana pueden ser eliminadas por bacterias que crecen en cultivos planctónicos44,45,46. En las condiciones de cultivo de E. coli utilizadas en nuestros experimentos, numerosos viriones de progenie se ensamblaron en las células infectadas entre 45 y 65 minutos después de la infección (Figura complementaria 10J-L). Las pocas partículas formadas inicialmente se distribuyeron aleatoriamente; sin embargo, con el tiempo después de la infección, los viriones de la progenie se ensamblaron en matrices regulares, como se describió anteriormente2.

un segmento de célula de E. coli infectada 45 minutos después de la infección contiene fagos SU10 en varias etapas del ciclo de infección. Los viriones fuera de la célula se muestran en turquesa, los intermediarios de liberación del genoma con boquillas formadas en azul oscuro, las partículas vacías en cian y los viriones descendientes dentro de la célula en rojo. Las membranas celulares internas y externas están resaltadas en naranja oscuro y naranja respectivamente, las vesículas en naranja claro, los ribosomas en azul claro, la matriz de quimiorreceptores en verde y el flagelo en violeta. Las posiciones de las partículas de fagos, los ribosomas (EMD-13270) y la matriz de quimiorreceptores (EMD-10160) se identificaron mediante la coincidencia de plantillas tal como se implementa en EMclarity64,65, y las correspondientes estructuras de alta resolución se colocaron en el tomograma. b Esquema del virión SU10. c Mecanismo de unión de SU10 y entrega del genoma. (1) El virión SU10 se adhiere a la superficie celular a través de largas fibras de la cola. (2) La unión de las seis fibras largas de la cola posiciona al fago con su eje largo perpendicular a la membrana bacteriana. La aguja de la cola puede interactuar con la membrana exterior. (3) Las fibras cortas de la cola giran hacia la membrana celular y las proteínas de la boquilla se enderezan para formar una boquilla. (4) La aguja de la cola se disocia de la cola. Las proteínas de eyección se liberan desde la cabeza del fago, degradan el peptidoglicano de la pared celular y extienden la boquilla del fago para formar un canal a través del periplasma. Se inicia la expulsión del ADN SU10 al citoplasma bacteriano. (5) La partícula vacía permanece asociada a la célula.

Las imágenes confocales de Airyscan de células de E. coli con membranas y genomas marcados, que fueron infectadas por SU10 con ADN marcado, verificaron que numerosas partículas de fagos se unen y entregan sus genomas a una célula (Figura complementaria 10C-F). La señal de fluorescencia del ADN del fago marcado fue detectable en el citoplasma celular hasta la lisis celular, e incluso se incorporó a la progenie de viriones (Figura complementaria 10I, L). Las células infectadas conservaron su unidad de forma nativa 45 minutos después de la infección, sin embargo, a los 65 minutos perdieron turgencia (Figura complementaria 10J-L).

La unión inicial del virión SU10 a los receptores en la membrana externa de E. coli está mediada por fibras largas de la cola, que tienen dominios de unión al receptor en sus extremos distales (Fig. 7b, c). Las estructuras del intermediario de liberación del virión SU10 y del genoma difieren en la dirección en la que las fibras de la cola larga apuntan en dirección opuesta a los complejos adaptadores (Fig. 2c, d). Las fibras largas de la cola en el intermediario de liberación del genoma están rotadas 6,6° con respecto a su orientación en el virión. Especulamos que en condiciones nativas este cambio conformacional es inducido por la unión del fago a la membrana bacteriana. Además, el movimiento de las fibras largas de la cola probablemente interrumpe sus interacciones con las fibras cortas de la cola y, por lo tanto, las prepara para la formación de la boquilla de la cola. La unión de las seis fibras de cola larga SU10 a los receptores posiciona al fago con su eje largo perpendicular a la membrana bacteriana (Fig. 7a, c). La supuesta interacción de la aguja de la cola con la membrana bacteriana desencadena cambios conformacionales en las proteínas de la boquilla, que conducen a la interrupción de la interacción del dominio cuatro de la boquilla con la fibra corta de la cola. Al organizarse en una línea recta paralela al eje de la cola, los dominios de la boquilla dejan espacio para que la rotación de 135° de las fibras cortas de la cola apunte en dirección opuesta a la cabeza del fago. Las fibras cortas de la cola y las proteínas de la boquilla se alternan para formar una boquilla de 277 Å de largo (Fig. 7c). La formación de la boquilla permite que los dominios de unión al receptor previstos de las fibras de la cola corta interactúen con los receptores en la superficie celular. La unión de las fibras cortas de la cola a los receptores puede forzar la aguja de la cola, que sobresale de la boquilla, a través de la membrana exterior de E. coli. Posteriormente, la aguja de la cola se disocia de la cola para permitir la apertura del canal de la cola (Fig. 7c). Las proteínas de eyección probablemente se expulsan de la cabeza SU10 antes o junto con el comienzo del genoma. Las proteínas de eyección forman un canal de translocación a través del espacio periplásmico y la proteína de eyección gp20, con actividad transglicosilasa, degrada el peptidoglicano de la pared celular. El genoma del fago se entrega al citoplasma de E. coli a través de un canal formado por la boquilla y el canal de translocación (Fig. 7c).

El fago SU10 se propagó en la cepa ECOR10 de E. coli, cultivada a 37 °C en caldo nutritivo (Oxoid). El lisado de fagos de 300 ml de cultivo bacteriano se trató con turbonucleasa (Abnova) (concentración final 5 unidades/ml), se centrifugó a 6000 x g durante 20 minutos a 4 °C y se filtró a través de un filtro de jeringa de polietersulfona de 0,45 μm. Los fagos del filtrado se sedimentaron mediante centrifugación a 54.000 x g durante 2,5 h a 4 °C en un rotor de 50,2 Ti (Beckman Coulter). Los sedimentos de fagos se disolvieron mediante incubación durante la noche en 6 ml de un tampón de fagos (Tris-Cl 50 mM, NaCl 10 mM, CaCl2 10 mM, pH 8,0) a 4 °C. Los sedimentos disueltos se superpusieron sobre un gradiente de densidad de CsCl escalonado (3 ml de cada solución de CsCl en tampón de fagos con densidades de 1,45 g/ml, 1,50 g/ml y 1,70 g/ml) y se centrifugaron a 210.000 x g durante 4 h a 12 °C. utilizando un rotor SW40Ti (Beckman Coulter). Se recogieron bandas que contenían partículas de fagos utilizando una aguja y una jeringa de calibre 0,8 mm. El cloruro de cesio se eliminó mediante diálisis contra el tampón de fagos a 4 °C durante la noche utilizando un tubo de diálisis Visking tipo 8/32 pulgadas, 0,05 mm de espesor (n.º de pieza 1780.1, Carl Roth, Alemania).

La muestra de fagos purificados (1012 UFP/ml) se diluyó 10 veces usando una solución de urea 3 M en el tampón de fagos y se incubó a 42° durante 30 minutos. Después de la incubación, la muestra se diluyó 3 veces en el tampón de fagos y se trató con turbonucleasa (Abnova) a una concentración final de 3,5 unidades/ml durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las partículas de fagos se sedimentaron mediante centrifugación a 75.000 x g a 4 ° durante 1 h en un rotor de 50,2 Ti (Beckman Coulter) y se resuspendieron en el tampón de fagos. La composición proteica de los viriones SU10 y los intermedios de liberación del genoma se compararon mediante electroforesis en gel SDS y análisis de espectrometría de masas.

El fago SU10 purificado se resuspendió en tampón Laemmli y se hirvió durante 3 minutos, luego la muestra se trató con turbonucleasa a una concentración final de 2 unidades/ml (Abnova) durante 15 minutos a temperatura ambiente. Las proteínas se separaron mediante electroforesis en gel con gradiente de tricina. Todas las bandas de proteínas principales se cortaron del gel y se usaron para análisis de espectrometría de masas. El procesamiento y análisis de datos de espectrometría de masas se realizaron utilizando el software FlexAnalysis 3.4 y MS BioTools (Bruker Daltonics). Se utilizó el software Mascot (Matrix Science, Londres, Reino Unido) para búsquedas de secuencias en espectros MS/MS exportados en comparación con la base de datos del Centro Nacional de Información Biotecnológica y una base de datos local provista de las secuencias de proteínas esperadas. La tolerancia masiva de péptidos y fragmentos de MS/MS para las búsquedas de iones de MS/MS fue de 50 partes por millón y 0,5 Da, respectivamente. Para todas las búsquedas se establecieron la oxidación de metionina y la propionilamidación de cisteína como modificaciones opcionales y una división errónea de una enzima. Se consideraron los péptidos con una puntuación peptídica estadísticamente significativa (P <0,05).

Se pipeteó una solución de fagos purificada (4 µl) con una concentración de 1012 UFP/ml sobre una rejilla de cobre perforada recubierta de carbono (R2/1, malla 200; Quantifoil), se secó y se vitrificó sumergiéndola en etano líquido usando un FEI Vitrobot Mark IV. . La muestra vitrificada se transfirió a un microscopio electrónico Thermo Fisher Scientific Titan Krios operado en condiciones criogénicas y a un voltaje de aceleración de 300 kV. El haz se alineó para iluminación paralela en modo NanoProbe y se realizaron alineaciones sin coma para eliminar la inclinación residual del haz. Se recogieron micrografías de viriones SU10 con un aumento de 59.000x en un detector de electrones directo Falcon III que funciona en modo lineal, lo que dio como resultado un tamaño de píxel calibrado de 1,38 Å/pix. Las imágenes se realizaron en condiciones de dosis bajas (dosis total 49 e−/Å2) y valores de desenfoque que oscilaron entre −1,2 y −2,7 μm. La exposición de un segundo se dividió en 40 fotogramas y se guardó como película. El conjunto de datos de los intermediarios de liberación del genoma se recopiló con un aumento de 105.000 x en un detector de electrones directo K2 Summit que funciona en modo de conteo, lo que dio como resultado un tamaño de píxel calibrado de 1,34 Å/pix. Las imágenes se realizaron en condiciones de dosis bajas (dosis total 52 e−/Å2) y valores de desenfoque que oscilaron entre −1,2 y −2,7 μm. La exposición de ocho segundos se dividió en 40 fotogramas y se guardó como película. Las adquisiciones de datos automatizadas se realizaron utilizando el software EPU (detector Falcon III) o Serial EM (detector K2 Summit). Las películas se corrigieron por movimiento global y localmente (parches de 5 × 5) utilizando el software MotionCor247 y se guardaron como micrografías ponderadas por dosis. Los valores de desenfoque se estimaron a partir de micrografías alineadas sin dosis ponderadas utilizando el programa Gctf48.

Se utilizaron rejillas de viriones SU10 preparadas para la adquisición de una sola partícula para registrar series de inclinación de tomografía que cubrían un rango angular de −60° a +60° con incrementos de 2°, con el esquema de inclinación bidireccional en condiciones de dosis bajas utilizando SerialEM. Cada serie de inclinación se recopiló con un valor de desenfoque nominal de −6 µm. Cada imagen se adquirió como una película de 7 cuadros en un detector Falcon II operado en modo de conteo usando una dosis de 1 e- /Å2 por inclinación. La dosis acumulada total para cada serie de inclinación fue de 57 e- /Å2. El tamaño de píxel calibrado fue de 1,8 Å. Las tomografías se reconstruyeron utilizando eTomo del paquete IMOD49. Los subtomogramas de las cabezas de los viriones SU10 se promediaron utilizando el programa PEET50,51 del paquete IMOD con simetría D5 aplicada.

CrYOLO del paquete de software de la red neuronal SPHIRE se entrenó en un subconjunto de imágenes de cabezas de viriones SU10 seleccionadas manualmente52. La selección automática final se realizó en 4 micrografías agrupadas utilizando crYOLO. Las coordenadas de las partículas resultantes se corrigieron para el factor de agrupación y se extrajeron imágenes de partículas (tamaño de cuadro 1296 × 1296 píxeles) de las 9.000 micrografías originales sin agrupar utilizando Relion53. Las partículas se agruparon a 256 px (6,99 Å/píxel) utilizando agrupamiento de espacio recíproco implementado en el paquete de software Xmipp54. Se realizaron varias rondas de clasificación 2D en Relion para seleccionar viriones intactos del conjunto de partículas seleccionadas automáticamente. El modelo inicial de la cabeza SU10 a partir del promedio de subtomograma se filtró de paso bajo a una resolución de 30 Å. Se realizaron varias rondas de clasificación y refinamiento 3D con simetría C5 impuesta utilizando Relion 3.1. Se utilizó el paquete de software Spider55 para preparar una máscara cilíndrica que excluye el genoma del fago para evitar que la señal del genoma interfiera con la reconstrucción de la cápside. Después del refinamiento automático inicial con simetría C5 impuesta, se realizó la clasificación 3D sin el paso de alineación. Se seleccionaron partículas pertenecientes a la mejor clase para un mayor refinamiento automático de Relion con simetría C5 impuesta y desviaciones máximas permitidas de las orientaciones anteriores de 10°. A medida que aumentó la resolución de la reconstrucción, las partículas se separaron gradualmente a 512 px (3,49 Å/píxel) y 1296 px (1,38 Å/píxel). La reconstrucción simetrizada de C5 final se enmascaró con un umbral, se dividió por la función de transferencia de modulación y se agudizó el factor B durante el posprocesamiento en Relion 3.1. Para mejorar aún más la resolución de la cápside, dividimos la cápside en tapa simétrica C5 sin cola, parte central simétrica D10 y tapa simétrica C5 con cola. Todas estas partes se volvieron a extraer en cajas más pequeñas y sus reconstrucciones se refinaron mediante búsquedas angulares locales. Para obtener una reconstrucción asimétrica de la cola del fago y la cápside circundante, se realizó una relajación simétrica de C5 a C1 utilizando el programa relion_relax_symm (Figura complementaria 11).

Se utilizaron orientaciones de partículas de la reconstrucción C5 de la cabeza del fago para extraer imágenes de subpartículas centradas en portales y colas de viriones SU10. Las imágenes de subpartículas se sometieron a varias rondas de clasificaciones 2D, lo que permitió la selección de conjuntos de datos homogéneos. Después del refinamiento automático inicial con simetría C12 impuesta para el portal y simetrías C6 y C3 para la cola, se realizaron clasificaciones 3D sin el paso de alineación. Se seleccionaron partículas pertenecientes a las mejores clases para un mayor refinamiento automático de Relion con simetrías impuestas y desviaciones máximas permitidas de orientaciones anteriores de 10°. Los mapas resultantes se enmascararon con un umbral, se dividieron por la función de transferencia de modulación y se agudizó el factor B durante el posprocesamiento en Relion (Figura 11 complementaria).

Se utilizaron orientaciones de partículas de la reconstrucción C6 de la cola del fago para extraer imágenes de subpartículas centradas en la aguja de la cola del virión SU10. Las imágenes de subpartículas se sometieron a varias rondas de clasificaciones 2D, lo que permitió la selección de un conjunto de datos homogéneo. Después del refinamiento automático inicial con simetría relajada establecida en C3, se realizó la clasificación 3D sin el paso de alineación. Se seleccionaron partículas pertenecientes a la mejor clase para un mayor refinamiento automático de Relion con simetría C3 impuesta y desviaciones máximas permitidas de orientaciones anteriores de 10 ° (Figura complementaria 11).

Para obtener una reconstrucción asimétrica de todo el virión SU10, las orientaciones de la reconstrucción de la cabeza simetrizada de C5 se relajaron usando relion_relax_symm. Se utilizó el paquete de software Spider55 para preparar una máscara esférica que cubre la cola del fago y 40 nm de la cápside.

La reconstrucción inicial se realizó en imágenes de partículas agrupadas en 256 px (6,99 Å/píxel), utilizando un factor de regularización alto y permitiendo solo búsquedas rotacionales. La exitosa relajación de la simetría fue verificada por la presencia de características biológicamente relevantes en las partes de la reconstrucción que pertenecen tanto a la cabeza como a la cola del fago. Posteriormente, las reconstrucciones continuaron con datos agrupados en 512 px (3,49 Å/píxel) y 1296 px (1,38 Å/píxel) (Figura complementaria 11).

Los intermedios de liberación del genoma SU10 se empaquetaron manualmente utilizando e2boxer del paquete de software EMAN256. Las coordenadas de partículas resultantes se utilizaron para extraer partículas de las 5688 micrografías utilizando Relion53,54. Las partículas se agruparon a 256 px (6,99 Å/píxel) utilizando agrupamiento de espacio recíproco implementado en el paquete de software Xmipp54. Se realizaron varias rondas de clasificación 2D en Relion para seleccionar intermedios de liberación del genoma intacto del conjunto de partículas. La reconstrucción de la cápside del virión SU10, filtrada de paso bajo a una resolución de 30 Å, se utilizó como modelo inicial para la reconstrucción 3D en Relion. Se realizaron varias rondas de clasificación y refinamiento 3D con simetría C5 impuesta utilizando Relion 3.1. El mapa resultante se enmascaró con un umbral, se dividió por la función de transferencia de modulación y se agudizó el factor B durante el posprocesamiento en Relion (Figura complementaria 12).

Se utilizaron orientaciones de partículas de la reconstrucción C5 de la cápsida del intermediario de liberación del genoma SU10 para extraer imágenes de subpartículas centradas en las colas. Las imágenes de subpartículas se sometieron a varias rondas de clasificaciones 2D, lo que permitió la selección de un conjunto de datos homogéneo. Después del autorrefinamiento inicial con simetría C6 impuesta, se realizó la clasificación 3D sin el paso de alineación. Se seleccionaron partículas pertenecientes a la mejor clase para un mayor autorefinamiento de Relion con simetría C6 impuesta y desviaciones máximas permitidas de las orientaciones anteriores de 10°. El mapa resultante se enmascaró con un umbral, se dividió por la función de transferencia de modulación y se agudizó el factor B durante el posprocesamiento en Relion (Figura complementaria 12).

Se utilizaron orientaciones de partículas de la reconstrucción C5 de la cápside del intermedio de liberación del genoma SU10 para extraer imágenes de subpartículas centradas en la parte superior de la cápside. Las imágenes de subpartículas se sometieron a varias rondas de clasificaciones 2D, lo que permitió la selección de un conjunto de datos homogéneo. Se expandió la simetría C5 de las partículas y se realizó la clasificación 3D en diez clases sin el paso de alineación. Se seleccionaron partículas pertenecientes a las mejores clases y se eliminaron los duplicados de partículas de la expansión de simetría. Las partículas resultantes se utilizaron para un mayor autorrefinamiento de Relion sin simetría y con desviaciones máximas permitidas de las orientaciones anteriores de 10 ° (Figura complementaria 12).

Las estructuras de PDB se construyeron usando el programa COOT47 (proteína portal, proteína adaptadora, residuos 1-90 de fibra de cola larga y dominio proximal de fibra de cola corta), construidas automáticamente usando Deep Tracer57 (proteína de boquilla) o modeladas usando Alphafold234 (central y receptor). -dominios de unión de fibra de cola corta y aguja de cola). Las estructuras se refinaron iterativamente en el espacio real usando el programa PHENIX real_space_refine.py58 y se corrigieron manualmente en COOT47 e ISOLDE59. La calidad de las estructuras y su ajuste a los mapas de densidad crio-EM se evaluó mediante una validación exhaustiva en el programa PHENIX. Las curvas FSC de las reconstrucciones crio-EM se presentan en la Fig. 13 complementaria. El modelo para mapear curvas FSC de estructuras individuales y ejemplos del ajuste de los modelos PDB a las densidades crio-EM se muestran en la Fig. 14 complementaria.

Las estructuras de las proteínas SU10 que no se resolvieron en reconstrucciones crio-EM con una resolución suficiente para permitir la determinación estructural se predijeron utilizando una instalación local del multímero AlphaFold 2.1.2. El software se instaló desde https://github.com/deepmind/alphafold, utilizando un entorno Dockerizado. Para la predicción, se utilizaron bases de datos recomendadas por los autores de AlphaFold en el momento de la instalación (invierno de 2021) (BFD, MGnify, PDB70, PDB, PDB seqres, Uniclust30, UniProt, UniRef90)34.

El mapa compuesto del virión SU10 se preparó combinando segmentos de reconstrucciones de subpartículas de regiones del virión SU10. Las reconstrucciones de subpartículas de regiones del virión SU10 se ajustaron a la reconstrucción asimétrica del virión SU10 completo utilizando Chimera60,61,62 (el comando Ajustar en mapa). El mapa compuesto se construyó a partir de las siguientes reconstrucciones: reconstrucción de la cápside simetrizada C5; portal de reconstrucción de cuello simetrizado de C12; adaptador, fibras de cola largas, boquilla y fibras de cola cortas de reconstrucción de cola simetrizada C6; y reconstrucción con aguja de cola simetrizada C3. Los segmentos de reconstrucciones de subpartículas se combinaron en el mapa compuesto utilizando el siguiente procedimiento: (1) Se generaron máscaras que cubren las estructuras PDB de las proteínas componentes utilizando pdb2mrc. (2) Las máscaras se ampliaron con seis vóxeles y cuatro vóxeles adicionales de borde suave (Relion3 - relion_mask_create). (3) Las reconstrucciones de subpartículas se multiplicaron por las máscaras correspondientes (Relion3 - relion_image_handler). (4) Para cada umbral de segmento se seleccionó para su visualización la estructura de todo el componente con el máximo de detalles resueltos. Para un mapa de fibra de cola corta con resolución decreciente a lo largo de la fibra, se seleccionaron tres segmentos con diferentes umbrales. (5) Los mapas de segmentos se normalizaron utilizando la máscara de mapa CCP4. (6) Los segmentos normalizados se combinaron en el mapa compuesto final usando el comando Chimera vop add onGrid. El mapa compuesto del intermedio de liberación del genoma SU10 se preparó utilizando el mismo procedimiento a partir de la cápside reconstruida con simetría C5 y la cola reconstruida con simetría C6.

Se infectó un cultivo de E. coli ECOR10 (OD = 0,3) en crecimiento exponencial con el bacteriófago SU10 (MOI = 10) preteñido con DmaO (BIOTIUM) en presencia de CaCl2 0,002 M. La infección se realizó en un portaobjetos de cultivo celular Cellview PS 75/25 mm con fondo de vidrio (Greiner bio-one) a 37 °C, con agitación de 100 RPM y se dejó continuar durante 5, 25, 45 y 65 min. Las membranas bacterianas y el ADN se tiñeron con SynaptoRed (BIOTIUM) (concentración final 4 μM) y DAPI (Roche) (concentración final 300 nM). Para obtener imágenes, las muestras se fijaron con una mezcla de glutaraldehído y formaldehído (0,125% y 4%, respectivamente) en un tampón fosfato 50 mM (pH = 7,5). Para evitar el movimiento durante la obtención de imágenes, las muestras se cubrieron con agarosa al 1% de bajo punto de fusión en el tampón de fagos.

Se tomaron imágenes de las muestras utilizando un microscopio confocal Zeiss LSM 880 con Airyscan en modo RS, con excitación de fluoróforo en las siguientes longitudes de onda: DAPI a 405 nm, DmaO a 488 nm y SynaptoRed a 514 nm. Los datos se procesaron con ZEN Black y se visualizaron con Fiji63.

Un cultivo en crecimiento exponencial de E. coli ECOR10 (OD = 0,3) se infectó con el bacteriófago SU10 (MOI = 10). Se dejó que la infección progresara durante 5, 25, 45 y 65 min. Se sedimentaron 1,5 ml de cultivo bacteriano infectado mediante centrifugación a 10.000 x g durante 1 min a 4°. Los sedimentos se resuspendieron en 15 µl de tampón de fagos y se mantuvieron en hielo. Se aplicaron marcadores fiduciales de oro (perlas de 10 nm) a la rejilla de cobre perforada recubierta de carbono (R3.5/1, malla 200; Quantifoil) para microscopía electrónica, se impregnaron con papel de filtro y se cubrieron inmediatamente con 4 µl de suspensión celular. Posteriormente, las rejillas se secaron y vitrificaron sumergiéndolas en etano líquido usando un Vitrobot Mark IV. Las series de inclinación tomográfica que cubren un rango angular de −60° a +60° con incrementos de 3° se registraron automáticamente utilizando un esquema de inclinación dosissimétrica en condiciones de dosis bajas en un detector de electrones directo K2 Summit, ubicado detrás del filtro de energía en el Titán. Microscopio Krios. Cada serie de inclinación se recopiló con un valor de desenfoque nominal de −6 µm y se adquirió como una película que contiene 5 fotogramas en el modo de conteo del detector, usando una dosis de 2 e−/Å2 por inclinación. La dosis acumulada total para cada serie de inclinación fue de 57 e- /Å2. El tamaño de píxel calibrado fue de 4,33 Å. Los tomogramas se reconstruyeron y visualizaron utilizando IMOD del paquete de software eTomo58. Las membranas y flagelos se segmentaron utilizando el programa Amira64. Las posiciones de las partículas de fagos, los ribosomas (EMD-13270) y la matriz de quimiorreceptores (EMD-10160) se identificaron mediante la coincidencia de plantillas tal como se implementa en EMclarity64,65, y las correspondientes estructuras de alta resolución se colocaron en el tomograma utilizando scripts internos. https://github.com/fuzikt/tomostarpy.

Más información sobre el diseño de la investigación está disponible en el Resumen de informes de investigación de la naturaleza vinculado a este artículo.

Las reconstrucciones crio-EM y las estructuras PDB correspondientes se depositaron bajo los siguientes códigos EMDB y PDB: Estructuras del virión SU10: cápside con simetría quíntuple EMD-14488 y PDB-7Z49, reconstrucción de cápside asimétrica EMD-14492 y PDB-7Z4B, parte superior de la cápside EMD -14485 y PDB-7Z46, centro de la cápside EMD-14484 y PDB-7Z45, fondo de la cápside EMD-14487 y PDB-7Z48, reconstrucción asimétrica del fondo y la cola de la cápside EMD-14489 y PDB-7Z4A, cuello con simetría doce veces EMD-14483 y PDB-7Z44, cola con simetría séxtuple EMD-14486 y PDB-7Z47, aguja de cola con simetría triple EMD-14909 y mapa compuesto de todo el virión EMD-14977. Estructuras del intermediario de liberación del genoma: cápside con simetría quíntuple EMD-14490, cola con simetría séxtuple EMD-14495 y PDB-7Z4F, parte superior de la cápside EMD-14491 y mapa compuesto del intermediario de liberación del genoma completo EMD-14920.

Los scripts para posicionar estructuras de alta resolución en las tomogramas están disponibles en https://github.com/fuzikt/tomostarpy.

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Descargar referencias

Agradecemos la instalación central de tomografía y microscopía crioelectrónica CEITEC MU y la instalación central de proteómica de CIISB, centro Instruct-CZ apoyado por MEYS CR (LM2018127) por su ayuda para obtener los datos científicos presentados aquí. Agradecemos a la instalación central CELLIM, respaldada por el gran proyecto RI Czech-BioImaging (LM2018129 financiado por MEYS CR) por su apoyo en la obtención de los datos científicos presentados en este artículo. Apreciamos enormemente el acceso a las instalaciones de computación y almacenamiento propiedad de las partes y a los proyectos que contribuyen al MetaCentrum de Infraestructura de Red Nacional, proporcionados en el marco del programa Proyectos de Gran Infraestructura para Investigación, Desarrollo e Innovaciones (LM2010005). Este estudio fue apoyado por el Centro de Excelencia IT4Innovations (proyecto CZ.1.05/1.1.00/02.0070). Este trabajo, incluidos los esfuerzos de Pavel Plevka, fue financiado por la subvención LL1906 del Ministerio Checo de Educación, Juventud y Deportes ERC-CZ Consolidator, la subvención GA18-17810S de la Fundación Checa de Ciencias y el proyecto Instituto Nacional de Virología y Bacteriología (Programa EXCELES, ID Proyecto No. LX22NPO5103) - Financiado por la Unión Europea - Next Generation EU. Los financiadores no tuvieron ningún papel en el diseño del estudio, la recopilación e interpretación de datos, ni en la decisión de enviar el trabajo para su publicación.

Instituto Central Europeo de Tecnología, Kamenice 753/5, 625 00, Brno, República Checa

Marta Šiborová, Tibor Füzik, Michaela Procházková, Jiří Nováček y Pavel Plevka

Facultad de Ciencias, Universidad Masaryk, Kamenice 753/5, 625 00, Brno, República Checa

Martin Benešík

Departamento de Biociencias Moleculares, Instituto Wenner-Gren, Universidad de Estocolmo, 106 91, Estocolmo, Suecia

Anders Nilsson

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Conceptualización PP; metodología M.Š., TF, MP, JN y MB; validación M.Š. y TF; análisis formal M.Š., MP, JN y MB; investigación M.Š., MP, JN y MB; recursos AN; curación de datos M.Š. y TF; redacción: preparación del borrador original M.Š., TF y PP; redacción: revisión y edición de M.Š., TF y PP; visualización M.Š. y TF; supervisión PP; adquisición de financiación PP

Correspondencia a Pavel Plevka.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Nature Communications agradece a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo. Los informes de los revisores pares están disponibles.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

Acceso Abierto Este artículo está bajo una Licencia Internacional Creative Commons Attribution 4.0, que permite el uso, compartir, adaptación, distribución y reproducción en cualquier medio o formato, siempre y cuando se dé el crédito apropiado a los autores originales y a la fuente. proporcione un enlace a la licencia Creative Commons e indique si se realizaron cambios. Las imágenes u otro material de terceros en este artículo están incluidos en la licencia Creative Commons del artículo, a menos que se indique lo contrario en una línea de crédito al material. Si el material no está incluido en la licencia Creative Commons del artículo y su uso previsto no está permitido por la normativa legal o excede el uso permitido, deberá obtener permiso directamente del titular de los derechos de autor. Para ver una copia de esta licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Reimpresiones y permisos

Šiborová, M., Füzik, T., Procházková, M. et al. Las proteínas de la cola del fago SU10 se reorganizan en la boquilla para la entrega del genoma. Nat Comuna 13, 5622 (2022). https://doi.org/10.1038/s41467-022-33305-w

Descargar cita

Recibido: 31 de enero de 2022

Aceptado: 12 de septiembre de 2022

Publicado: 24 de septiembre de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41467-022-33305-w

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