Correlación entre las propiedades biológicas y mecánicas de la matriz extracelular de metástasis peritoneales colorrectales en tejidos humanos.

Scientific Reports volumen 13, número de artículo: 12175 (2023) Citar este artículo

Las metástasis peritoneales (PM) son vías comunes de diseminación del cáncer colorrectal (CCR) y siguen siendo una enfermedad letal con mal pronóstico. Las propiedades de la matriz extracelular (MEC) son importantes en el desarrollo del cáncer; estudiar sus cambios es crucial para comprender el desarrollo del CRC-PM. Estudiamos las propiedades elásticas de las ECM derivadas de muestras humanas de PM normales y neoplásicas mediante microscopía de fuerza atómica (AFM); los resultados se correlacionaron con los datos clínicos de los pacientes y la expresión de los componentes de la ECM relacionados con la diseminación metastásica. Mostramos que la progresión de PM se acompaña de un endurecimiento de la ECM, un aumento de la actividad de los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) y un aumento de la deposición y la reticulación en matrices neoplásicas; por otro lado, en las MEC neoplásicas también se encuentran regiones más blandas en las mismas escalas. Nuestros resultados apoyan la hipótesis de que los cambios locales en la ECM normal pueden crear el terreno para el crecimiento y la propagación del tumor de las células metastásicas invasoras. Hemos encontrado correlaciones entre las propiedades mecánicas (rigidez relativa entre la ECM normal y neoplásica) de la ECM y los datos clínicos de los pacientes, como la edad, el sexo, la presencia de mutaciones activadoras de proteínas en los genes BRAF y KRAS y el grado del tumor. Nuestros hallazgos sugieren que el fenotipado mecánico de PM-ECM tiene el potencial de predecir el desarrollo de tumores.

La metástasis peritoneal (MP) afecta aproximadamente a uno de cada cuatro pacientes con cáncer colorrectal (CCR)1. El desarrollo de MP se caracteriza por varios pasos en los que las células cancerosas se diseminan desde el tumor primario hasta la cavidad peritoneal2, a través de un proceso también conocido como cascada metastásica peritoneal2,3. Para colonizar el peritoneo, las células neoplásicas deben poder infiltrarse en la matriz extracelular (MEC), a partir del desprendimiento del tumor primario, unirse al tejido conectivo submesotelial y recibir una respuesta favorable del huésped2.

La MEC es un elemento acelular esencial del microambiente tisular, que desempeña un papel crucial en varios procesos de la homeostasis tisular4. La MEC determina la estructura tridimensional (3D) del tejido y proporciona soporte mecánico y bioquímico, desempeñando un papel importante en la comunicación célula-célula y célula-matriz y en la migración celular 4,5. Además, en las últimas décadas se ha demostrado claramente el papel crucial de la MEC en la progresión del cáncer6,7,8,9,10,11.

El microambiente extracelular está compuesto de agua, diversas proteínas fibrosas (es decir, colágenos, elastinas, lamininas, fibronectinas), proteoglicanos, glicoproteínas y polisacáridos; la MEC del tejido específico tiene composición y topología únicas, lo que resulta en el desarrollo de las propiedades bioquímicas y mecánicas de cada órgano y tejido1,4,5.

La MEC puede considerarse un elemento dinámico del tejido, ya que sufre diversos cambios en su composición y reordenamientos de sus propios componentes, a través de modificaciones covalentes y no covalentes, que se asocian con la actividad de las células en el desarrollo del tejido, y también con enfermedades graves y progresión del cáncer5,12.

Tanto los cambios mecánicos como los bioquímicos en la MEC están regulados por factores de crecimiento, hormonas, citoquinas y metaloproteinasas (MMP)6. Las propiedades elásticas de la MEC, junto con la actividad de factores bioquímicos específicos, desempeñan un papel clave en la homeostasis tisular, el destino celular, la adhesión celular, la migración, la progresión del ciclo celular, la diferenciación y la reorganización y contractilidad del citoesqueleto relacionada con la actina6,12,13,14. La matriz es una entidad biomecánica de múltiples escalas que muestra características mecánicas complejas como viscoelasticidad, plasticidad mecánica y elasticidad no lineal8,15. Las propiedades viscoelásticas y también bioquímicas de la ECM están determinadas principalmente por los colágenos y su grado de reticulación8,15. Los estudios AFM de ECM confirmaron las propiedades viscoelásticas de este compuesto tisular16,17. Cada vez hay más pruebas de que las células pueden detectar y reaccionar ante el viscoelástico, en lugar de ante las propiedades mecánicas estáticas de las ECM15.

Durante la progresión del cáncer, la MEC sufre muchos cambios estructurales y bioquímicos, como un aumento de la deposición de colágeno, entrecruzamiento de fibras y también cambios en la expresión genética4,5,6,12,13,14. De hecho, el endurecimiento de la MEC se puede observar en tejidos premalignos y malignos6,12, se asocia con alta malignidad/agresividad y peor pronóstico7,13,14,18 y conduce a una mayor resistencia al tratamiento en la mayoría de los tumores6.

Los fibroblastos asociados al cáncer (CAF) pueden originarse a partir de diferentes tipos de células, incluidos los fibroblastos residentes y las células mesoteliales, que experimentan una transición mesotelial a mesenquimatosa (MMT)1,19 y son fundamentales para la progresión de la enfermedad metastásica. Los CAF supervisan la producción de proteínas de la MEC como colágeno, fibronectina y varias otras, así como proteasas y otras enzimas involucradas en la modificación postranscripcional de las proteínas de la MEC19,20,21. La activación de CAF y la deposición de colágeno, que conducen a un aumento general del módulo elástico de la ECM (endurecimiento), se encuentran entre los signos de progresión del cáncer. Por tanto, la detección del endurecimiento de la MEC a escala celular podría permitirnos detectar los primeros signos de desarrollo tumoral y controlar la progresión del cáncer desde su inicio. Además, una mejor comprensión del proceso de endurecimiento de la MEC y la interacción célula-MEC asociada podría ayudar a desarrollar estrategias terapéuticas más eficientes para la prevención o el tratamiento del cáncer.

La microscopía de fuerza atómica (AFM) es una herramienta potente y versátil para estudiar muestras biológicas a escala nano y micro, incluida la investigación cuantitativa de sus propiedades morfológicas y mecánicas en múltiples escalas de longitud22,23,24,25,26,27,28. 29. Las propiedades mecánicas de las células, las ECM y los tejidos pueden caracterizarse por AFM17,25,26,27,30,31,32,33,34,35 y podrían constituir una huella digital mecánica única de la progresión del cáncer36.

Nuestro trabajo partió de la hipótesis de que el estudio por AFM de las propiedades nanomecánicas de células, MEC y tejidos, cuando se complementa con el análisis de la expresión de componentes específicos de la MEC y con metadatos clínicos, puede proporcionar una contribución importante a la comprensión de los mecanismos que conducen a la desarrollo del PM. Por tanto, hemos estudiado los cambios en las propiedades mecánicas de la ECM peritoneal en pacientes afectados por CRC-PM. En particular, hemos caracterizado el módulo de elasticidad de Young de muestras de ECM mediante mediciones de indentación realizadas por AFM25. Los resultados del análisis nanomecánico se han correlacionado con la presencia de CAF y la organización del colágeno en las muestras de ECM, para obtener información sobre las diferencias fisicoquímicas entre ECM normales y neoplásicas, y con metadatos de pacientes para intentar identificar marcadores mecánicos relacionados con un estado fisiopatológico específico.

La heterogeneidad de las muestras de ECM estudiadas se puede apreciar en los gráficos de violín que se muestran en la Fig. 1A. En varios casos, la distribución YM parece claramente multimodal. Resulta que a menudo el valor YM de la moda de orden más alto es similar (es decir, la distribución muestra una superposición significativa) al valor YM de una moda líder en la distribución de la muestra neoplásica (ver, por ejemplo, pacientes 1,2,3). ,6,7,8).

Distribuciones YM para las condiciones normales (verde) y neoplásicas (rojo) de las MEC peritoneales para los 14 pacientes considerados en el estudio. (A) Gráficos de violín obtenidos agrupando todos los valores de YM de todos los FC adquiridos en todas las regiones de interés (ROI) para una condición específica. El valor mediano está representado por un punto blanco y las líneas negras gruesas representan los cuartiles superior e inferior. (B) Gráficos que muestran la distribución de los valores medianos de YM medidos a partir de todos los volúmenes de fuerza (FV) recopilados en diferentes ROI para cada condición específica (puntos verdes y negros). Las barras negras representan la media de los valores medianos y la correspondiente desviación estándar de la media, respectivamente (consulte la sección "Estadísticas"). El asterisco indica significancia estadística de la diferencia (p < 0,05).

La Figura 1B muestra la distribución de los valores medianos de YM medidos en diferentes ubicaciones de las muestras de ECM para las condiciones y los pacientes probados. En algunos casos, la rigidez es estadísticamente significativa, en otros no, aunque a menudo se observa un aumento en el valor medio de YM. Se observó un endurecimiento estadísticamente significativo (es decir, aumento del valor YM de la condición normal a la condición neoplásica) de la ECM derivada de CRC-PM en ocho pacientes (4–6 y 9–13), que también se encontraban entre los de mayor edad: 82, 66 y 71 años, respectivamente, para los pacientes 4-6 y 63, 67, para los pacientes 10-13. Sin embargo, el proceso de rigidez también estuvo presente en los pacientes 7, 8 y 9, que son significativamente más jóvenes (47, 43 y 45 años) (Fig. 1B).

Tanto para los tejidos normales como para los neoplásicos, la distribución de los valores de YM es bastante amplia. Dentro del mismo tejido, observamos una variabilidad muy amplia de un paciente a otro. Por ejemplo, para el tejido normal, observamos un factor de diferencia de ~ 17 entre el valor de YM de los pacientes 5 y 3; para la condición neoplásica observamos un factor de diferencia de ~8 entre el valor de YM de los pacientes 8 y 5. Estos resultados resaltan, entre otros aspectos, la importancia de identificar referencias internas dentro de un mismo paciente; en nuestro caso, esto está representado por la ECM normal recolectada a varios centímetros de la lesión cancerosa.

Para comprender mejor los eventos biológicos que sustentan las propiedades mecánicas de la ECM, seleccionamos seis casos diferentes (pacientes) y analizamos la actividad de CAF relacionada con la deposición y orientación del colágeno mediante αSMA y tinción con rojo Picrosirius (Figs. 2 y 3). Se seleccionaron pacientes cuyas ECM exhiben diferentes propiedades mecánicas (sin diferencias mecánicas, rigidez moderada y significativa entre dECM normal y neoplásica).

Imágenes de muestras de tejido de los pacientes 2, 6, 8 y 12-14, para visualización de núcleos celulares (tinción DAPI) y αSMA, aumento 10x; La longitud de la barra de escala es de 50 µm.

Imágenes de muestras de tejido de los pacientes 2, 6, 8 y 12-14, para visualización de colágeno y tinción de control (tinción con rojo Picrosirius y hematoxilina y eosina (H&E), respectivamente), aumento ×4; La longitud de la barra de escala es de 100 µm.

Cinco de los seis pacientes mostraron una expresión baja de αSMA en muestras de origen normal, aunque las regiones estromales mostraron una alta expresión de αSMA localizada (Fig. 2). Curiosamente, también observamos una alta expresión de αSMA alrededor de los vasos sanguíneos (ver pacientes 6, 8 y 13), un signo del proceso de neoangiogénesis, una característica bien conocida del cáncer y la diseminación metastásica. Las muestras derivadas de neoplasias mostraron una mayor expresión de αSMA en los pacientes 2, 6, 8, 12; mientras que no se observaron diferencias claras en la actividad de CAF en los pacientes 13 y 14. El paciente 13 mostró una expresión baja de αSMA tanto en tejidos normales como neoplásicos, mientras que el paciente 14 mostró una expresión alta de αSMA en ambos tejidos. Para tres de seis pacientes, diferencias claras en la expresión de αSMA (ver Tabla 1) se correlacionaron con el endurecimiento de la ECM, mientras que el paciente 14 no mostró diferencias en αSMA y no se observaron diferencias en el YM medido de las dos condiciones. Como se puede observar en el caso de muestras derivadas de condiciones normales, la expresión de αSMA está presente, lo que sugiere que ya se están produciendo modificaciones neoplásicas del entorno en un área perilesional (es decir, una región del tejido que está sana pero cerca de la masa tumoral). . En los pacientes 2, 8 y 12 (normal), la distribución de la rigidez fue bimodal (Fig. 1A) y se observó una distribución similar para la expresión de αSMA.

Luego evaluamos la orientación de las fibras de colágeno mediante tinción con rojo Picrosirius (Fig. 3). Los resultados mostraron que las muestras normales tenían una mayor deposición de fibras de colágeno en áreas estromales y de vasos sanguíneos (Fig. 3), mientras que las muestras derivadas de neoplasias se caracterizaban por una orientación irregular y porosa de las fibras de colágeno, con un patrón de morfología similar a corrugado (Fig. .3, ver pacientes 2, 6, 8, 12-14). En general, los resultados de colágeno se correlacionaron con la expresión de αSMA (ver Tabla 1), lo que demuestra el papel activo de CAF en la producción y depósito de colágeno durante la diseminación metastásica (Figs. 2 y 3). Nuevamente, observamos que algunas muestras de origen normal exhibían un patrón de colágeno similar a neoplásico, también en línea con la expresión de αSMA, particularmente en el paciente 14.

Para comprender mejor cómo se relacionan la respuesta mecánica y las modificaciones de la ECM con la PM, buscamos correlaciones entre las propiedades biofísicas observadas y los datos clínicos de los pacientes.

Primero probamos si el módulo de Young de la MEC normal estaba correlacionado con la edad de los pacientes involucrados, ya que se ha informado rigidez relacionada con la edad tanto a nivel celular como de MEC/tejido37,38,39,40,41. Los resultados se muestran en la Fig. 4A. Es posible observar una clara tendencia hacia el ablandamiento de la MEC normal a medida que aumenta la edad de los pacientes (el paciente 13, con un carcinoma neuroendocrino colorrectal, no incluido en la Fig. 4A, mostró una disminución en línea con la tendencia general).

(A) Valores de YM (valor medio ± estándar de la media) de ECM sanas de los 13 pacientes afectados por adenocarcinoma versus su edad (los círculos y las cruces representan hombres y mujeres, respectivamente). (B) Valores de YM como en (A) para pacientes que no (-) y (+) se sometieron a quimioterapia. (C – H) Rigidez relativa de las MEC neoplásicas de los mismos pacientes, versus: (C) tratamiento quimioterápico; (D) la edad de los pacientes; (E) la presencia de mutaciones activadoras de proteínas en los genes KRAS y BRAF; (F) el sexo de los pacientes; (G) histología: adenocarcinoma mucinoso MA, adenocarcinoma AS de sigma, adenocarcinoma A, grado tumoral H.

Para investigar si el ablandamiento podría deberse a los tratamientos a los que se sometieron los pacientes, verificamos la correlación con la quimioterapia (Fig. 4B), pero no encontramos evidencia significativa de su impacto en las propiedades elásticas de la ECM, a pesar de una distribución más amplia de Valores de YM para pacientes tratados con quimioterapia. Para evitar sesgos relacionados con el tratamiento previo, calculamos la rigidez relativa de las MEC neoplásicas versus normales dentro de cada paciente, ya que ambos tejidos se sometieron a los mismos tratamientos. La rigidez relativa se calculó como la diferencia entre los valores de YM de la ECM neoplásica y normal, normalizados al valor de YM de la ECM normal. La Figura 4C confirma que la quimioterapia no se correlaciona con el endurecimiento de la MEC.

La Figura 4D muestra que existe una tendencia hacia un aumento de la rigidez relativa con la edad de los pacientes. Tenga en cuenta que el paciente 13, con un carcinoma neuroendocrino colorrectal, mostró el mayor aumento en la rigidez (hasta un 1200 %, y cuatro veces mayor que el segundo mayor aumento relativo). La rigidez muy elevada observada en el paciente 13, en comparación con los demás pacientes, puede ser un signo de diferentes modificaciones mecánicas entre los tipos de tumores. Sin embargo, dado que los tumores neuroendocrinos son extremadamente raros, nuestras observaciones no son estadísticamente significativas y no es posible una comparación con el grupo PM; Por lo tanto, el paciente 13 fue excluido del análisis informado en la Fig. 4.

Probamos si el endurecimiento está relacionado con la presencia de mutaciones en los genes KRAS y BRAF que activan constitutivamente las proteínas correspondientes (Fig. 4E). La presencia/ausencia de estas mutaciones es importante para el diagnóstico (p. ej., los tumores con mutaciones en BRAF tienen peor pronóstico) y para la elección del tipo de tratamiento a administrar al paciente, ya que se dispone de fármacos con acción selectiva para la presencia /ausencia de mutaciones específicas. Estas mutaciones son muy frecuentes en el CCR metastásico y se prueban de forma rutinaria para la selección del tratamiento terapéutico. Observamos una diferencia (aunque no significativa) entre el endurecimiento relativo de las ECM que portan proteínas que activan mutaciones KRAS y BRAF, que parecían ser mayores en los casos con mutaciones de KRAS. Los casos no mutados abarcaron una gama más amplia de rigidez relativa, abarcando la de los casos mutados.

Además, decidimos buscar correlaciones entre la rigidez relativa y el sexo de los pacientes, ya que se sabe que el CCR es más frecuente en hombres que en mujeres, aunque las diferencias en mortalidad parecen insignificantes42. La Figura 4E muestra que las mujeres tienen una rigidez más pronunciada, aunque no significativa. No hay datos sobre este tema, por lo que podría ser interesante comprobar las variaciones relacionadas con el sexo en las propiedades mecánicas de otros tejidos, como en el caso de las enfermedades cardiovasculares, que se sabe que afectan más a los hombres que a las mujeres43.

También probamos si existen diferencias en las propiedades mecánicas en relación con la clasificación histopatológica del tumor (Tabla 2). La Figura 4G muestra que no existen diferencias evidentes en el aumento relativo del YM de la ECM de las diferentes histologías.

Finalmente, analizamos las diferencias en el grado tumoral de las muestras analizadas. El grado del tumor describe un tumor en términos de anomalías de las células tumorales en comparación con las células normales. Un grado bajo indica un tumor de crecimiento más lento que un grado alto. Todos los pacientes fueron diagnosticados con grado 2 y grado 3; Los resultados de la correlación entre el grado del tumor y la rigidez relativa se muestran en la Fig. 4H. Se puede observar que el grupo de grado 3 (G3) muestra una rigidez significativamente mayor que el grupo de grado 2 (G2).

Los cambios en las propiedades nanomecánicas de los tejidos son una de las características de la progresión tumoral4,44,45. Al comprender los procesos detrás de ellos, podríamos explotar este conocimiento para implementar el diagnóstico del cáncer y otras enfermedades basado en el fenotipado mecánico a nano y microescala. Aquí, nos centramos en la investigación de las modificaciones mecánicas en la ECM descelularizada derivada de CRC-PM.

Según los estudios de AFM en muestras de ECM de 14 pacientes, observamos una tendencia general de endurecimiento de la ECM durante el desarrollo de la lesión neoplásica (Fig. 1). Nuestros resultados concuerdan con datos publicados previamente sobre ECM de otros tipos de cáncer10,46,47.

Las distribuciones multimodales medidas, no simplemente amplias, de los valores de YM, sugieren que la ECM posee una heterogeneidad estructural, compositiva y, por lo tanto, también mecánica significativa en la escala de medición de AFM (10-100 µm). Además, la superposición parcial de las distribuciones de los valores de YM de diferentes condiciones (normales y neoplásicas) reveló la complejidad de la progresión de la enfermedad durante el proceso metastásico, que se caracteriza por una alta heterogeneidad espacial a escala celular y supracelular. La teoría de las semillas y el suelo sugiere que la ECM sufre cambios, incluidos los mecánicos, para preparar un microambiente adecuado para la proliferación de células neoplásicas48. La presencia de regiones más rígidas en muestras normales, comparables a las típicas de los casos neoplásicos, sugiere que los cambios locales que preparan el terreno para la invasión metastásica en el tejido normal ocurren lejos de la lesión existente, probablemente causados por la liberación de factores que en última instancia pueden alterar las propiedades mecánicas del ECM48. La práctica común para los estudios de cáncer es obtener una muestra no tumoral a 10-15 cm de distancia del tumor31. Nuestros resultados sobre las propiedades mecánicas de la ECM muestran que la práctica de considerar el tejido ubicado a 10-15 cm de la lesión cancerosa como no tumoral podría ser incorrecta. Los tejidos de los cuales se obtuvieron muestras se recolectaron durante CRS-HIPEC (cirugía citorreductora: quimioterapia intraperitoneal hipertérmica). Por lo tanto, el análisis AFM se realizó en tejidos que ya se encontraban en estado metastásico avanzado, que fueron útiles para caracterizar la ECM de áreas peritoneales normales y tumorales. Las cohortes candidatas para el cribado basado en la mecánica de la AFM probablemente deberían incluir casos recopilados durante la laparoscopia diagnóstica para el diagnóstico de MP, cuando la enfermedad todavía está localizada en áreas pequeñas y cuando el área perilesional probablemente esté menos afectada por cambios metastásicos. Una o más biopsias alrededor de la lesión metastásica permitirán determinar la extensión de la enfermedad y la posterior decisión de tratamiento.

La tinción para αSMA, una proteína específica de CAF expresada en fibroblastos, que es un signo de progresión del cáncer y un marcador típico de desmoplasia19, detectó cambios en el microambiente circundante que normalmente conducen al desarrollo de nichos metastásicos específicos. Dado que también observamos áreas con alta expresión de αSMA en muestras normales, es probable que hayan sufrido modificaciones inducidas por factores prometastásicos específicos liberados por células metastásicas PM cercanas. Estos resultados confirmaron que la formación de nichos premetastásicos ya ocurre en tejido derivado normal, ya que también observamos áreas de alta expresión de αSMA en muestras normales (Fig. 5).

La figura resume los principales eventos moleculares y físicos que contribuyen al desarrollo del nicho metastásico peritoneal y a la remodelación de la MEC. Las células cancerosas ejercen su efecto sobre el microambiente de la metástasis peritoneal a través de tres modos principales: (1) la liberación de factores de crecimiento específicos, como el TGFβ, que conduce al reclutamiento de fibroblastos residentes y su activación en CAF. (2) La producción de exosomas que desencadenan el microambiente y median la activación de CAF y la polarización de macrófagos en el fenotipo M2. (3) La producción de citoquinas proinflamatorias, que contribuyen a mejorar la actividad de los CAF y los macrófagos M2 promoviendo la vía del TGFβ de forma paracrina. En conjunto, estos eventos contribuyen a la producción y/o depósito de MEC no tratada y al aumento concomitante de la rigidez de la MEC, tanto alrededor del sitio de la lesión como en sitios distantes de la cavidad peritoneal, lo que puede ser un signo de progresión de la enfermedad.

También se observó una mayor expresión de αSMA en áreas ricas en vasos sanguíneos (pacientes 6, 8 y 13). Durante el proceso metastásico, los CAF pueden distribuirse a través de los vasos sanguíneos para desarrollar los llamados nichos metastásicos perivasculares, que pueden sostener la activación de las células estromales en el tejido normal a través del TGF-β y la secreción de interleucinas y citocinas proinflamatorias y pleiotrópicas, que también contribuir a iniciar modificaciones en el ECM, incluido el refuerzo. La combinación de estos eventos genera un microambiente más adecuado para apoyar la propagación metastásica, en particular la angiogénesis19,21,48. La expresión de αSMA en áreas vascularizadas indica pasos tempranos de invasión metastásica en tejidos normales (Fig. 5).

La expresión de αSMA fue mayor que la del tejido normal en cuatro de los seis pacientes y la actividad CAF se correlacionó con una mayor deposición de colágeno; sin embargo, dos pacientes (8 y 13) mostraron resultados no correlacionados entre la tinción y las diferencias mecánicas de la ECM normal y neoplásica. Según estos resultados, parece que parte del tejido que se consideraba normal ya tenía características cancerosas.

Otro paso para comprender mejor las diferencias entre la ECM normal y neoplásica fue visualizar las fibras de colágeno I y III, ya que su sobreexpresión y remodelación están estrictamente relacionadas con la progresión del cáncer4,5,6,26,45. Nuestros resultados mostraron la expresión y organización típica de las fibras de colágeno ya observadas en estudios previos sobre diferentes tipos de MEC10,34,49. La organización de las fibras de colágeno estaba estrictamente correlacionada con la expresión de αSMA; La expresión de esta proteína confirmó la reticulación del colágeno en la ECM neoplásica pero también, en menor medida, en la ECM normal. Los tumores con alta desmoplasia (entrecruzamiento de fibras) se consideran más agresivos y con peor pronóstico6. En las muestras neoplásicas, el aumento de la reticulación y la reestructuración de las fibrillas de colágeno en la ECM y el endurecimiento de la matriz producen un entorno extracelular propicio para la invasión y el crecimiento del tumor. Los cambios en el área perilesional vascularizada y más rígida podrían ser un circuito de retroalimentación para difundir las características neoplásicas de la MEC. Los miofibroblastos son conocidos por su remodelación de la MEC, que implica la deposición de novo de receptores específicos involucrados en la mecanoseñalización por la MEC, lo que contribuye a la remodelación del tejido tanto normal como patológico50.

La correlación de estos resultados con los datos clínicos de los pacientes sugiere una clara tendencia al ablandamiento de los tejidos en pacientes mayores. Este resultado es algo inesperado, considerando que se ha informado un endurecimiento relacionado con la edad tanto a nivel de células como de MEC/tejido37,38,39,40,41; El daño y la inflamación del tejido debido a una condición inflamatoria prolongada relacionada con la presencia del tumor32 podrían explicar nuestra observación. Excluimos que el ablandamiento pueda estar directamente relacionado con los tratamientos de quimioterapia, ya que no encontramos ninguna correlación evidente en nuestros pacientes (Fig. 4B, C).

Luego centramos el análisis en el endurecimiento relativo de las MEC neoplásicas versus normales en cada paciente individual. El análisis de las propiedades mecánicas según la presencia de mutaciones en los genes KRAS y BRAF que determinan la activación constitutiva de las proteínas correspondientes y según el grado del tumor mostró que los pacientes con mutaciones en el gen KRAS tenían una rigidez relativa ligeramente mayor, mientras que un aumento relativo más fuerte es relacionado con diferentes grados de tumor (G3 > G2). Dado que la presencia de mutaciones activadoras de proteínas en los genes KRAS y BRAF es muy común en la PM y el grado del tumor es un parámetro que caracteriza el comportamiento de las células tumorales, probablemente estén asociadas con características mecánicas específicas. Estos datos son todavía preliminares y se investigarán con experimentos adicionales en una cohorte más amplia de casos. Creemos que tales correlaciones ayudarían a avanzar en el desarrollo de pruebas biomecánicas para complementar las técnicas de diagnóstico clínico estándar.

Comprender cómo las modificaciones de las propiedades mecánicas de la ECM influyen en la invasión metastásica también puede tener el potencial de desarrollar tratamientos tisulares activos que puedan afectar la migración celular; La ECM ya se está utilizando como soporte para el cultivo celular con el fin de comprender mejor los mecanismos de interacción entre la célula y el microambiente26,46,51,52,53,54,55.

En conclusión, demostramos que en CRC-PM, el endurecimiento de la ECM se correlaciona con la deposición y remodelación de colágeno, la actividad de CAF, la edad de la cirugía y el grado del tumor. El análisis mecánico con resolución espacial de muestras de origen humano reveló una heterogeneidad espacial significativa en las propiedades elásticas de la ECM normal y neoplásica. Los resultados, junto con la alta expresión de αSMA, revelaron que los signos de formación de nicho premetastásico ya están presentes en el tejido normal, y la correlación de los datos mecánicos con los metadatos del paciente mostró conexiones interesantes entre el endurecimiento relativo y las características del tumor en sí. particularmente con la edad y el grado del tumor de los pacientes. Nuestros resultados sugieren que la caracterización a nano y microescala de las propiedades mecánicas del tejido puede sugerir la presencia de metástasis y ayudar en los procedimientos de diagnóstico.

Con el tiempo, una investigación químico-mecánica más detallada, que considere todas las propiedades viscoelásticas de los tejidos y las correlacione con las abundancias relativas de los componentes moleculares individuales que caracterizan la ECM, ayudaría a crear una base de datos futura para enfoques de diagnóstico elaborados basados en estudios cuantitativos mecánicos. para complementar las técnicas clínicas estándar.

Las ECM se obtuvieron del tejido peritoneal de 14 pacientes diagnosticados con CRC-PM (información más detallada se encuentra en la Tabla 2).

Las muestras se recolectaron durante la resección quirúrgica en la Unidad de Neoplasias Peritoneales de la Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori di Milano como se describe en Varinelli et al.46 El estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Fondazione IRCCS Istituto Nazionale Tumori di Milano (134/13; I249/19) y se llevó a cabo siguiendo la Declaración de Helsinki de 2009. Todos los experimentos se realizaron de acuerdo con las directrices y regulaciones pertinentes. Se obtuvo el consentimiento informado por escrito de todos los participantes.

Brevemente, se recogieron tejidos no tumorales a 10 cm de distancia del tumor, de acuerdo con los procedimientos clínicos estándar31. Se obtuvieron muestras de matriz extracelular descelularizada 3D (3D-dECM) derivadas de neoplásicos y normales como se describe en Genovese et al.56. Se incluyeron 3D-dECM en OCT y luego se congelaron en un baño de nitrógeno líquido con isopropanol. Se cortaron muestras congeladas de 2 a 3 pacientes al mismo tiempo en rodajas de 100 a 200 µm de espesor y se inmovilizaron en portaobjetos de vidrio polarizado (Thermofisher, Walthan, EE. UU.). Las criosecciones se almacenaron a -20 °C y se utilizaron para las mediciones de AFM inmediatamente después de la preparación; las mediciones de todas las muestras preparadas solían durar hasta dos semanas, durante las cuales las muestras a estudiar en una sesión específica se sacaban del congelador, se descongelaban y se enjuagaban, como se describe a continuación. En los casos en que se necesitaba un almacenamiento más prolongado (más de 1 mes), las criosecciones se mantuvieron en un congelador a -80 °C.

Las mediciones nanomecánicas se realizaron a temperatura ambiente (aproximadamente 25 °C), utilizando un Bioscope Catalyst AFM (Bruker) montado sobre un microscopio óptico invertido (Olympus X71). Para aislar el AFM del ruido acústico y del suelo, el microscopio se colocó sobre una base antivibración activa (DVIA-T45, Daeil Systems) dentro de un recinto acústico (Schaefer, Italia).

Antes de las mediciones de AFM, se mantuvo una criosección a temperatura ambiente durante 15 minutos para fundir la OCT. Posteriormente, la criosección se colocó en un tubo con PBS frío para eliminar la OCT. La presencia de OCT podría afectar la medición al provocar una fuerte adhesión entre la punta y la OCT. Además, las mediciones realizadas en ECM cubiertas con OCT impedirían el contacto mecánico adecuado entre la punta y la muestra. Se realizaron dos lavados, de 5 a 10 min cada uno57.

Las mediciones AFM de criosecciones se realizaron en una gota de PBS confinada por un círculo de tinta hidrófoba. Las mediciones también se realizaron en PBS para evitar la adhesión de la punta a la muestra y la desnaturalización de la ECM.

Las mediciones nanomecánicas basadas en AFM se realizaron de acuerdo con procedimientos estándar, basados en la adquisición de curvas de indentación, como se describe en Refs25,58. El proceso de medición se describe esquemáticamente en la Fig. 6. Hemos utilizado sondas coloidales personalizadas con puntas esféricas hechas de perlas de vidrio de borosilicato con un diámetro (el doble del radio R) en el rango de 18 a 25 µm, producidas a partir de voladizos sin punta de nanosensores TL-FM y calibrado como se describe en Ref.59. Estas grandes puntas permiten promediar efectivamente la respuesta mecánica del ECM estructuralmente complejo. Las constantes de resorte de las sondas AFM (típicamente 5 a 6 N/m, necesarias para lograr indentaciones de varios μm con una punta grande) se calibraron utilizando el método de ruido térmico60,61. La sensibilidad a la deflexión del aparato de deflexión del haz óptico (en unidades de nm/V) se calculó como la inversa de la pendiente de las curvas de fuerza versus distancia (simplemente curvas de fuerza, FC) recogidas sobre un sustrato rígido (el portaobjetos de vidrio que sostiene el muestra)58 o utilizando el procedimiento SNAP sin contacto62.

Representación esquemática de la medición nanomecánica. (A) Imagen óptica de una ECM (peritoneo normal derivada del paciente 8), con el voladizo AFM y la región de interés seleccionada para el experimento de indentación. Los cortes con un espesor de entre 100 y 200 μm son semitransparentes, lo que permite seleccionar regiones para el análisis que parezcan suficientemente uniformes y suaves. La cuadrícula roja representa las ubicaciones donde se adquieren las curvas de fuerza (FC) (longitud de la barra de escala: 50 µm). En el recuadro se muestra la configuración experimental para las mediciones de indentación y el sistema de desviación del haz óptico. (B) Fuerza de aproximación reescalada típica versus curva de indentación. El círculo rojo resalta el punto de contacto. Sólo la porción de la curva caracterizada por una sangría positiva se considera para el ajuste hertziano (ecuación (1) y también se muestra en el recuadro). (C) El mapa de los valores del módulo de Young extraídos por los FC adquiridos en la región de interés que se muestra en (A). (D) Histograma que representa la distribución de los valores de YM representados en el mapa mecánico en (C). Bajo la hipótesis de una distribución log-normal, un ajuste gaussiano en escala semi-logarítmica permite identificar el valor mediano de YM, como el centro de la curva gaussiana.

Las muestras se estudiaron recogiendo un conjunto de FC, también llamados volúmenes de fuerza (FV), en diferentes regiones de interés (ROI). Cada FV normalmente cubría un área entre 50 µm × 50 µm y 125 µm × 125 µm y constaba de 100 a 225 FC. Se eligió que la separación entre FC adyacentes fuera mayor que el radio de contacto típico en la sangría máxima, para reducir las correlaciones entre FC vecinas. Para la condición de cada paciente (normal o neoplásica), se recolectaron varios FV en diferentes ubicaciones macroscópicamente separadas en cada muestra, con 2 a 3 muestras (criosecciones) por condición (normal versus neoplásica) para cada paciente. En total, para cada condición se recolectaron entre 2000 y 4000 FC. Un FC normalmente contenía 8192 puntos, con una longitud de rampa L = 15 μm, carga máxima Fmax = 800–1500 nN, frecuencia de rampa f = 1 Hz. La carga máxima se ajustó para obtener una sangría máxima de 4 a 6 μm en todas las muestras. Los datos sin procesar se reescalaron para producir curvas de fuerza versus indentación en unidades de nN y nm, respectivamente, como se explica en detalle en Refs25,61.

Los datos adquiridos se analizaron utilizando rutinas MATLAB personalizadas utilizando el protocolo descrito previamente en Puricelli et al.25. Las propiedades elásticas de los ECM se caracterizaron a través de su módulo de elasticidad de Young (YM), extraído ajustando el modelo no adhesivo de Hertz63,64 al rango de indentación del 20%-80% de los FC (detalles en Ref.23,25). :

lo cual se considera exacto siempre que la sangría δ sea pequeña en comparación con el radio R. De hecho, los análisis de elementos finitos mostraron que la ecuación. (1) es precisa para δ tan grande como R, cuando se utilizan perlas esféricas de tamaño micrométrico como penetradores (datos no publicados, véase también el efecto de fondo: resultados corregidos publicados en Ref.65). En la ecuación. (1), ν es el coeficiente de Poisson, que normalmente se supone igual a 0,5 para materiales incompresibles, y E es el YM. Con base en la inspección de la curva de fuerza, llegamos a la conclusión de que la adhesión entre la punta y las muestras es insignificante, por lo que se espera que el modelo de Hertz sea preciso.

No se aplicó la corrección de espesor finito25,66,67,68 ya que el espesor de los cortes de ECM (150–200 μm) es significativamente mayor que el radio de contacto esperado en la indentación máxima. El primer 20% de las FC normalmente se ignora, debido a la contribución de fibras superficiales no reticuladas, problemas de rugosidad de la superficie, etc.10.

Antes de la tinción con HC e IF, se prepararon y cortaron bloques fijados con formalina e incluidos en parafina (FFPE) como en Varinelli et al.46. Las secciones de FFPE se tiñeron con hematoxilina y eosina (H&E) para visualizar los núcleos y las regiones estromales. Para el análisis de HC, las secciones se tiñeron con rojo picrosirius (laboratorio ScyTek), para visualizar las fibras de colágeno, siguiendo las instrucciones del fabricante. El análisis IF de recuperación de antígeno se llevó a cabo como en Varinelli et al.46. Para los análisis de IF, las secciones de FFPE se tiñeron con actina alfa del músculo liso primaria (αSMA, 1:400), anticuerpo conjugado con FITC (Merck, KGaA) y DAPI (Merck, KGaA), siguiendo las instrucciones de los fabricantes, para visualizar respectivamente los fibroblastos asociados al cáncer. (CAF) y núcleos. Las imágenes se adquirieron con un microscopio DM6000B (Wetzlar, Alemania Leica) equipado con una lámpara de mercurio de 100 W y se analizaron utilizando el software Cytovision (Leica). Todos los experimentos se realizaron por triplicado.

La presencia de mutaciones activadoras de proteínas en los genes KRAS y BRAF se determinó utilizando el panel Ion AmpliSeqTM Cancer Hotspot (Thermo Fisher), que permite examinar regiones de puntos críticos de 50 oncogenes y genes supresores de tumores comúnmente mutados en cánceres humanos, con una amplia cobertura de KRAS y Genes BRAF. Se extrajo ADN de secciones FFPE de PM como en Varinelli et al.46 y se utilizó para análisis mutacional. Las bibliotecas se prepararon utilizando el kit IonAmpliSeq Library 2.0 (Thermo Fisher); La PCR en emulsión y la carga del chip se realizaron en el sistema IonChef (Thermo Fisher) y se ejecutaron en el IonGeneStudio S5 Prime (Thermo Fisher) usando el chip Ion 520 y el kit-chef Ion 510, Ion 520 y Ion 530 de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El procesamiento de datos brutos, la llamada de variantes y la anotación se realizaron como en Meazza et al.69.

La distribución de los valores de YM que es peculiar de cada ECM en las diferentes condiciones probadas (Fig. 1A), se ha creado agrupando todos los FC. Esto se justifica en parte por el hecho de que la distancia de curva a curva es del orden del radio de contacto máximo, y la separación entre FV de un mismo corte es comparable a la separación entre FV de diferentes cortes obtenidos del mismo paciente. Para resaltar la diversidad de condiciones mecánicas locales que se encuentran en las muestras, hemos utilizado gráficos de violín para representar las distribuciones YM.

Los valores representativos de YM para una condición específica de un paciente específico se han realizado agrupando los valores medianos de YM obtenidos de cada FV recopilados en diferentes ROI y calculando su valor medio y la desviación estándar correspondiente de la media32, asumiendo que los valores medianos deben ser distribuido normalmente según el teorema del límite central70. Las distribuciones de los valores medianos se muestran en la Fig. 1B. Un error relativo experimental de aproximadamente el 3%, evaluado utilizando un método de Monte Carlo71, teniendo en cuenta las incertidumbres en los factores de calibración (10% para la constante del resorte, 5% para la sensibilidad a la deflexión) se agregó en cuadratura a la desviación estándar de la media para estimar el error final asociado con los valores medianos medios de YM.

La significación estadística de las diferencias entre las condiciones probadas se evaluó mediante una prueba t de dos colas. En caso de un valor de p <0,05, la diferencia se consideró estadísticamente significativa.

Los conjuntos de datos generados y/o analizados durante el estudio actual están disponibles a través de los autores correspondientes previa solicitud razonable.

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Esta investigación fue financiada por el programa de investigación e innovación Horizonte 2020 de la Unión Europea en virtud del acuerdo de subvención Marie Skłodowska-Curie nº 812772, proyecto Phys2Biomed, y del acuerdo de subvención FET Open nº 801126, proyecto EDIT. Este trabajo fue apoyado por fondos “5 por 1000” (MUR 2019 y Ministerio de Salud 2015, apoyo financiero para la investigación): subvención institucional BRI 2021 “Aprovechamiento de la matriz extracelular para despertar la respuesta inmune en pacientes con metástasis peritoneal” asignada al Dr. Luca Varinelli, y por el Ministerio de Salud italiano, con acuerdo de subvención n.º RF2019-12370456. Agradecemos a los pacientes que participaron en el estudio. Agradecemos a Hatice Holuigue por su valioso apoyo y debates. Los autores agradecen el apoyo del fondo central APC de la universidad de Milán.

Departamento de Física “Aldo Pontremoli” y CIMaINa, Universidad de Milán, vía G. Celoria 16, 20133, Milán, Italia

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Departamento de Investigación, Fondazione IRCCS National Cancer Institute, via G. Venezian 1, 20133, Milán, Italia

Luca Varinelli y Manuela Gariboldi

Departamento de Patología y Medicina de Laboratorio, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, via G. Venezian 1, 20133, Milán, Italia

Silvia Brich

Unidad de Histopatología, Cogentech Ltd. Benefit Corporation con un único accionista, vía Adamello 16, 20139, Milán, Italia

Federica Pisati

Unidad de Neoplasias Malignas de la Superficie Peritoneal, Cirugía de Colon y Recto, Fondazione IRCCS Istituto Nazionale dei Tumori, via G. Venezian 1, 20133, Milán, Italia

Marcello Guaglio, Dario Baratti y Marcello Deraco

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Conceptualización: MG, AP; Metodología: EL, LV, MC, MG, AP; FP, SB, DB, M.Gu. Investigación: EL, LV; FP, SB Recursos: MG, AP, MD, DB Análisis de datos: EL, LV, MC, AP; Borrador original escrito: EL, MG, LV, AP; MC Revisión y edición de redacción: todos los autores; Supervisión: MG, AP

Correspondencia a Manuela Gariboldi o Alessandro Podestà.

Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

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Lorenc, E., Varinelli, L., Chighizola, M. et al. Correlación entre las propiedades biológicas y mecánicas de la matriz extracelular de metástasis peritoneales colorrectales en tejidos humanos. Representante científico 13, 12175 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-38763-w

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Recibido: 19 de diciembre de 2022

Aceptado: 14 de julio de 2023

Publicado: 27 de julio de 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-38763-w

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